化学冻伤处理方法篇1
1资料与方法、措施
1．1研究对象自2004年12月份入伍的新兵开始，连续统计4年新兵临床冻伤病例，共62例，占总人数的3．1%。62例中，男50例，女12例，年龄16~22岁，平均18岁，来自全国8个不同省份。冻伤面积在1%~9%之间，其中，Ⅰ、Ⅱ度冻伤患者52例(83．9%)；Ⅲ度冻伤9例(14．5%)；Ⅳ度冻伤1例(1．6%)。
1．2方法由连队每天登记冻伤的人数，并结合我院医疗人员的巡诊、门诊，经临床医生确诊。诊断及分度标准[1]：Ⅰ度冻伤(红斑性冻伤):伤及表皮层，局部红肿、充血；有热、痒、刺痛的感觉。Ⅱ度冻伤(水疱性冻伤):伤及真皮，局部明显充血、水肿，12~24h内形成水疱，疱液呈血清样。Ⅲ度冻伤(腐蚀性冻伤):伤及全层皮肤或皮下组织，创面由苍白变为黑褐色，感觉消失，创面周围红、肿、痛并有水疱形成。Ⅳ度冻伤(血栓形成与血管闭塞):损伤深达肌肉、骨骼，甚至肢体坏死，表面呈死灰色、无水疱；坏死组织与健康组织的分界在20d左右明显。
1．3治疗措施
1．3．1加强防冻保暖措施。确保了室内温度在20℃~25℃，一旦发现冻伤，迅速将伤员脱离冷环境送到诊疗室，进行全身和局部保暖，给予热饮料，迅速更换潮湿衣服鞋袜。
1．3．2迅速复温。冻伤发生后，应立即采取40℃~42℃温水迅速复温，使冻伤部位皮温在20~40min左右回升接近正常皮肤温度(表现为组织软化、皮肤潮红，尤其是指、趾甲床潮红)，严禁冷水泡、火烤或雪搓，以免加重损伤。
1．3．3密切观察病情变化，防止感染及相应并发症发生。Ⅰ度、Ⅱ度冻伤采取以上处理后，给予局部外敷冻伤膏，观察临床转归情况；Ⅲ度、Ⅳ度冻伤皮肤组织发生坏死，快速复温后，应立即采取有效措施，防止因循环改变引起的进行性损伤。给予阿司匹林、肝素、低分子右旋糖酐等抗血流淤滞的药物；高流量吸氧，以改善组织血氧供应；并积极抗感染治疗，同时要注意全身治疗和并发症的防治。
1．4治疗结果初次冻伤者46例，占74．2%；既往患有冻伤病史此次复发者16例，占25．8%。治愈率高达98．2%，复诊率为3．5%，感染率为3．2%。尤其近2年Ⅲ度、Ⅳ度冻伤明显下降，10例Ⅲ度、Ⅳ度冻伤患者除1例手术截除患肢(左食指)外，余9例通过植皮及综合治疗创面痊愈。
2讨论
2．1新兵冬季集训，特别是东北冬季寒冷的气候，长时间的户外训练是冻伤发生的主要原因，其次与个体自身素质、所处环境的取暖设施等有关。患者冻伤部位多数为手、耳、足等常暴露部位，容易引起功能障碍和致残。冻伤不同于烧伤，当时就能判定深度，一般要复温后和主要症状显露后才能作出判断。冻伤的轻与重在治疗上截然不同。冻结造成的损伤和冻融后的一系列改变是冻伤引起组织损伤和坏死的主要原因。冻结对组织的损伤一方面由于冰晶的机械性损伤，造成细胞的破坏，另一方面由于冰晶的形成主要发生在组织间液，使其形成高渗，导致细胞脱水，蛋白变性，酶活性下降，代谢障碍，以至坏死。冻伤损害主要发生在冻融后，局部血管扩张，充血，渗出，并可有血栓形成。组织内冰晶及其融化过程造成的组织破坏和细胞坏死，促使炎性反应介质释放，引起炎性反应，加以组织缺血再灌流造成细胞凋亡，构成了冻伤的病变[2，3]。Ⅰ、Ⅱ度冻伤经过伤处换药处理就能愈合，愈后结果良好。但Ⅲ度、Ⅳ度冻伤因存在组织坏死治疗比较复杂，治疗结果也因为治疗措施采取的早晚和是否得当而大不相同。Ⅲ度、Ⅳ度冻伤往往造成一定程度的功能障碍和伤残。尽量防止和减轻组织坏死以减轻愈后伤残和功能障碍是治疗的主要原则。
2．2做好新兵集训期间的宣传教育工作，提前做好防治冻伤的措施是明智之举。入伍后及时开展有关预防冻伤的健康教育，提高新兵对防冻伤的认识；要不断加强耐寒锻炼，注重保护好易暴露部位；注重户外训练时间和强度的安排，坚持以动制冻、以练胜寒、静中求动、以动防冻的原则；坚持三结合三防止，即运动和静止科目相结合，防止静止时间过久；强度大与强度小的科目相结合，防止出汗过多和过度劳累；室外与室内科目相结合，防止户外时间过长。以循序渐进的方式，逐渐达到适应冬季训练和训练成绩双提高的目的。再者搞好后勤保障，为预防冻伤提供物质基础。军需、营房方面提供舒适、保暖的服装及居住环境；生活方面合理选择和调配食品，增加高热量食物摄入，从而增强机体的抗寒能力。
总之，冻伤的防治不是哪一个部门的事，而是各单位相互协作、共同完成的一项工作，只有各部门、各单位齐心协力，才能降低冻伤的发生率，从而最小程度上影响新兵训练，圆满完成集训工作。
参考文献
［1］吴在德，吴肇汉.外科学.人民卫生出版社，2008:190-191.
化学冻伤处理方法篇2
【关键词】 氮冷冻;皮肤病;护理
【摘要】 [目的]探讨利用氮冷冻治疗皮肤病的相关操作方法和护理方法。[方法]108例病人分别采用接触法、喷雾法、棉签法将液氮直接作用于病人的皮肤表面，对患处实施治疗，并观察治疗效果和并发症情况。[结果]色素痣、寻常疣、扁平疣、尖锐湿疣、神经性皮炎的有效率均为100%，蜘蛛痣有效率1/2，雀斑有效率3/4，总有效率为98.1%。[结论]氮冷冻是治疗皮肤病的一种有效方法，通过掌握冷冻时间和深度，可以避免并发症的出现。
【关键词】 氮冷冻;皮肤病;护理
皮肤病是指皮肤受到内外因素的影响而造成的形态、结构和功能的变化，进而产生的病理过程，是严重影响人们生活和健康的常见病和多发病。皮肤病包括疥疮、麻风、皮肤细菌感染、真菌感染等，发病率高，但多数易于治疗，尚不会影响身体健康，极少数病情较重者可能危及到生命安全。随着生活水平的日益提高，人们对于健康和美的追求越来越热衷，不仅局限于治愈皮肤病，还较重视治疗后的美观，瘢痕和色素残留情况。液氮冷冻是目前皮肤科进行医疗美容的常用手段之一[1]，操作方法相对简便，治疗效果也较好，但要降低并发症发生率，则应注重护理细节。我院自2006年7月—2009年10月共收诊皮肤病病人108例，现将其治疗及护理回顾性总结如下。www.133229.Com
1临床资料
2006年7月—2009年10月，我院共收诊108例病人进行氮冷冻治疗，男52例，女56例;其中色素痣36例，寻常疣56例，扁平疣6例，尖锐湿疣3例，蜘蛛痣2例，雀斑4例，神经性皮炎1例。年龄8个月至72岁，平均年龄32.6岁，病程2个月至5年。部分病人在接受氮冷冻前接受过内服或外用药物治疗，但效果不佳。
2治疗及护理方法
2.1治疗方法
根据病人患处皮损程度大小和具体情况选择治疗方法。①接触法：适合于皮损面积较小、较局限者，皮损直径<0.3cm，比如血管瘤、瘢痕疙瘩等;治疗时间每次20s～30s，连续冷冻2次，直接用实施冷冻作业的器械接触患处治疗，待皮损处边缘出现发白时开始计时;②喷雾法：适用于面积相对较大、皮损处呈现高低不平的病人，通常直径>1.0cm，比如尖锐湿疣、疣状血管瘤、皮脂腺痣等;通常喷雾20s～30s，连续冷冻2次或3次，至皮损出现结霜变硬的情况;③棉签法：此方法简单易操作，且不受患处损伤大小、形态等限制，对多数病人普遍适用;通常根据皮损程度的不同，实施按压法进行治疗，应注意按压的时间和力度，受损皮肤组织变白即可停止按压，时间控制在20s～60s。以上治疗方法均为每周1次，并观察治疗效果，通常1次～3次即可痊愈，5次治疗后仍无效者视为治疗方法无效。
2.2疗效判断方法
痊愈：皮损消失，患处恢复正常，可有少量色素残留;显效：皮损大部分消失，患处有大部分恢复，但仍有损伤面;无效：皮损绝大部分没有变化或全部没有改变。有效率=(痊愈+显效)/总例数。
2.3护理方法
2.3.1心理护理
皮肤病常会从心理上给病人带来困扰，因此护理人员要关注病人的心理状态变化，要亲切耐心地为病人讲解，全心全意地体贴和爱护病人。在治疗前要对病人进行氮冷冻治疗讲解，并与病人商量需冷冻部位，听取病人意见。
2.3.2硬件准备
比如冷冻室的清洁，要保持宽敞明亮、良好通风环境。在治疗室里备有可供病人观察伤口变化的镜子，并准备风扇将液体排出氮气喷出后的气体化[2]。
2.3.3冷冻深度的把握
冷冻深度要考虑到患处位置，一般骨、软骨等部位就不宜施压过大，时间也要控制的相对短一些，以免冷冻深及骨质、造成骨损伤。手背、指侧的皮肤也应注意力度，避免神经的触碰和损伤。头面部对病人来说是最重视的部位，深度要适中，以免留下瘢痕。
2.3.4全身反应护理
个别病人在治疗过程中出现全身反应，主要为头痛、头晕、恶心、盗汗、心悸等。遇到此种不良反应，要立即停止冷冻，让病人平躺于床上休息，观察体温、脉搏和血压等的变化，直到病人恢复正常。
2.3.5局部反应的护理
①病人出现疼痛感：可在冷冻后使用冻伤膏来进行止痛，如患处为病人疼痛的敏感部位，则先给病人服用止痛药物，待半小时后再行冷冻治疗;②出现水疱：如水疱为局部，则施以包扎手法，如水疱较大甚至出现血疱，则要先用碘伏消毒，再进行包扎;③红斑水肿：部分病人在冷冻后出现红斑水肿状况，应进行无菌包扎，并嘱咐病人保持干燥，避免接触水。
3结果
表1不同皮肤病治疗效果
4讨论
4.1结论
氮冷冻是治疗皮肤病的一种有效方法，尤其对色素痣、寻常疣、扁平疣、尖锐湿疣、神经性皮炎的治疗效果更显著，有效率较高;而对蜘蛛痣、雀斑的治疗有效率相对较低。
4.2护理体会
通过掌握冷冻时间和深度，可以达到避免并发症出现的可能性。护理时应注重对病人的心理辅导，尤其是对年龄相对小[3]、对治疗不甚了解的病人。另外，注意在冷冻治疗过程中观察病人反应，一旦出现不良反应，应及时停止冷冻，采取正确措施减轻病人的不良反应。
4.3注意事项
①部分病人于治疗后可能出现局部疼痛、肿胀反应，通常1d或2d即可自动消失，如症状较重，可根据疼痛部件适当予以镇痛或消肿;②在病人痊愈前，要嘱咐其注意伤口不可触碰水，保持干燥，预防感染;③在头部毛发较多的部位进行治疗时，应使病人先行进行洗发和理发，后再进行治疗;④对雀斑病人，在结痂期间嘱病人不可搔抓，在痂未脱落前不可用水擦洗，同时避免紫外线直射，必要时戴上帽子和遮阳镜。
4.4液氮的使用
液氮是无色、无味的液体，是氮所凝华后的产物，不易燃，也不易爆炸。液氮的沸点在-196℃，是现代较常使用的冷冻剂[4]。用液氮进行皮肤病治疗，实际上是利用液氮的沸点低这一特性，通过特殊的治疗工具，将液氮直接接触病人皮肤患处，利用低温杀死患处细菌[5]。冷冻治疗法目前已经被广泛应用于皮肤科的临床治疗中，且效果显著。
【参考文献】
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[3]邝孝琼，林雪仪.液氮冷冻治疗皮肤病的操作及护理体会[j].现代临床医学生物工程学杂志，2004，10(2)：163164.
化学冻伤处理方法篇3
【摘要】目的探讨胡椒醇提液外用对兔耳轻度冻伤的治疗效果。方法用－15℃左右低温液复制兔耳轻度冻伤模型，冻伤后48h开始在兔冻耳涂抹胡椒70%乙醇提取液治疗，2d后测定血清中sod活性、mda和tnf-α含量，4d后评价冻耳外观正常与否及变形程度，制作冻耳组织病理切片，显微镜下观察冻耳组织病理变化，同时测定血清与冻耳组织中sod活性、mda和tnf-α含量。结果用胡椒70%乙醇提取液治疗2d后血清中sod活性显著增加，mda量显著降低，tnf-α量无明显变化。治疗4d后血清中sod活性、mda和tnf-α含量均无明显差异，但冻耳组织中sod活性与tnf-α水平显著提高，mda量显著降低。另外冻耳外观评价与组织病理检查显示冻耳组织坏死范围减少，修复速度明显提高。结论胡椒70%乙醇提取液局部外用对轻度冻伤有治疗作用。
【关键词】胡椒；冻伤；治疗作用
abstract：objectivetoinvestigatethetherapeuticeffectofalcoholextractfrompepperonmildandmoderatefrostbiteofrabbitear.methodstherightrabbitear,within7cmscopefromapexconchaeauristowardsulcusauriculaeposterior,wasimmersedintocoldliquidat-15℃toestablishanexperimentalmodelofmildandmoderatefrostbite.2dafterfrostbite,70%alcoholextractfrompepperwasappliedontosurfaceofearsfrozen.sodactivity,mdaandtnf-αlevelsinserumweredetermined2and4daftertreatment.thenafterapplicationfor4d,sodactivity,contentsofmdaandtnf-αintissueofearfrozenweredetected.inaddition,therecoveryprofilesofearfrozenlikeappearancevariablesandhistopathologicfeaturesweresurveyed.resultssodactivityinserumsignificantlyincreased2daftertreatmentwith70%alcoholextractfrompepper,mdalevelsignificantlydecreasedandtnf-αlevelhadnodifference.sodactivity,mdaandtnf-αconcentrationsinserumshowednodifferencesafteradministrationfor4d.intissueoftheaffectedear,sodactivityandtnf-αcontentswereobviouslyathighlevelsatthistime,mdacontentwastheopposite.ontheotherhand,theappearancereviewandhistopathologicexaminationbothmanifestedthattopicalapplicationof70%alcoholextractfrompepperdiminishednecroticregionsofearfrozen,acceleratedtissuerepairafterfrostbite.conclusion70%alcoholextractofpepperhaspharmacologicalactivityonmildandmoderatefrostbitehealing.
keywords：pepper;frostbite;therapeuticeffect
胡椒是传统中药，为胡椒科植物胡椒pipernigruml.的干燥近成熟或成熟果实。民间有用胡椒粉煮水或泡酒擦洗患处治疗冻疮的用法，并且疗效确切。笔者所在研究组欲对胡椒抗冻疮作用进行动物实验验证，通过查阅中外文献数据库（包括中国cnki和vip科技论文全文数据库，美国gale、pubmed和highwirepress数据库），未能检索到动物冻疮实验模型的报道。研究组曾根据冻疮病因病机试制动物冻疮模型，但均未成功。临床上认为ⅰ，ⅱ度（轻度）冻伤和冻疮的临床表现及治疗基本一致，因此在没有冻疮动物模型可用的情况下，药物对轻度冻伤的疗效仍可作为对冻疮治疗作用的参考，有积极意义。
兔耳冻伤后由于局部细胞发生变性或坏死，兔耳形态和组织结构会有所改变，变性的细胞如及时恢复供血供氧，清除损伤因子，能转为正常，反之，如持续缺血缺氧，则损伤可进一步加重，直至坏死。坏死表皮可由周围正常表皮再生修复，真皮坏死则只能通过肉芽组织填补修复，修复后兔耳形态和组织结构不能恢复正常；另外，因冻伤后机体氧化抗氧化系统平衡被打破，丙二醛（mda）和超氧化物歧化酶（sod）这对反映组织氧化损伤程度与抗氧化能力的生化指标会发生相应变化；近年来肿瘤坏死因子α（tnf-α）在创伤和创伤修复中的作用越来越受人们关注。现已证实，在创伤修复早期tnf-α能诱导白细胞脱颗粒，增强其吞噬能力，加速肉芽组织及肉芽组织内新生血管形成［1～3］。在修复中、后期高浓度tnfα能抑制成纤维细胞胶原蛋白基因的转录,同时可以引起胶原酶基因转录的显著增加,因而tnfα在组织的重塑中具有重要意义，可减少瘢痕组织形成，提高修复质量［4，5］。也就是说，在创伤修复早期适当浓度的tnfα能加速创面修复，中、后期高浓度tnfα能提高修复质量［6］。该文通过观察冻伤兔耳治疗后外观形态与组织病理改变情况，测定血清和冻耳组织中mda、sod、tnf-α含量综合评价胡椒局部外用对兔耳轻度冻伤的治疗作用，进而研究胡椒抗冻疮的效果。
1仪器与材料
1.1仪器
2010型酶标仪（奥地利anthoslabtecinstruments公司）；756mc紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2试药
取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24h），合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65g；mda和sod试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20071228，20071227）；tnfα试剂盒（美国adlitteramdiagnosticlaboratories公司，批号：rt110371）。
1.3动物
日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：scxk（滇）2005-0008。
2方法
2.1冻伤模型复制与给药
［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6d后将右耳耳尖至耳根7cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。待兔耳变白变硬后再冻30s，取出，空气中停留20s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1ml/次，3次/d，涂药4d后，治疗结束。
2.2冻耳治疗后外观评价
冻耳皱缩变形的范围大小反映了组织细胞坏死和瘢痕修复的范围大小，是药物对冻伤所致组织细胞变性的保护和促恢复作用的直接体现。此处将冻耳治疗后外观评价由好到差分为4级：正常（冻耳治疗后颜色、外观、触感和厚度与正常兔耳完全一样）、轻度变形(冻耳耳尖至耳根方向2cm区域内皱缩变形)、中度变形(耳尖至耳根方向4cm区域内皱缩变形)、重度变形(耳尖至耳根方向皱缩变形范围超过4cm)。
2.3冻耳病理检查
治疗4d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部分，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部分剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做sod、mda和tnf-α测定），分别在耳尖向耳根方向1，2，3cm处取材，常规石蜡包埋，he染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。
2.4sod、mda和tnfα测定
［8］涂药2d后，左耳中央动脉取血约4ml。涂药4d后心脏取血约4ml，取“2.3”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事先盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，取出，滤纸吸干水分，称1g耳尖部组织，用10ml预冷ph7.4的0.01mol/l的pbs制备组织匀浆。血液与组织匀浆4℃分别以4000r/min和2000r/min离心10min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方法测定sod总活力、mda与tnf-α含量。
2.5统计
所有数据均用spss13.0统计，其中冻耳治疗后外观评价用秩和检验mann-whitneyu法，sod、mda和tnfα测定结果用方差分析lsd法。
3结果
3.1冻耳外观变化
复温后兔耳开始发红发热，随后变紫、肿胀、下垂。肿胀逐渐加剧，12h后部分兔耳出现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成。24h后肿胀程度不再增加，水泡不再增大或无新水泡形成。48h后部分兔耳冻区有黄色液体渗出。治疗后冻耳肿胀逐渐消退，治疗结束（治疗4d）后各组冻耳均已不见明显肿胀。高、中浓度胡椒供试液组治疗结束后分别有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳（冻耳表皮光滑平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样），其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、表面凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳表面有硬痂产生。高浓度胡椒供试液组治疗结束后冻耳外观评价明显好于溶剂组（p<0.01）。结果见表1。表1胡椒对轻度冻伤兔耳形态改变的影响（略）
3.2冻耳治疗后病理变化
治疗后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完整，真皮水肿及炎症均明显消退，部分兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现（高浓度5只，低浓度3只），近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常（高浓度6只，中浓度4只），未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳总体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。
3.3sod测定结果
治疗2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中sod活力均显著高于溶剂组（p<0.01）。治疗4d后各组血清中sod活力已无明显差异，但冻耳组织中sod活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显著高于溶剂组（高浓度p<0.01，中浓度p<0.05）。结果见表2。表2胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中sod活力的影响（略）
3.4mda测定结果
治疗2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中mda量显著低于溶剂组（p<0.01）。治疗4d后各组血清中mda量均一定程度下降，与正常组相比已无明显差异，但此时冻耳组织中mda量有差异，高、中浓度胡椒供试液组显著低于溶剂组（高浓度p<0.01，中浓度p<0.05）。结果见表3。表3胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中mda含量的影响（略）
3.5tnf-α测定结果
治疗2d和4d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中tnf-α量与溶剂组相比均无明显差异，但治疗4d后冻耳组织中tnf-α量显著高于溶剂组（p<0.01）。结果见表4。表4胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中tnf-α含量的影响（略）
4讨论
兔耳冻伤后形态改变的范围实际上反映了冻耳存活的组织细胞面积和存活量。所以，治疗结束后，通过兔冻耳外观正常与否及形态异常范围可评价药物抗冻伤的疗效，药物如能减少耳冻伤后细胞坏死的数量和范围，则冻耳形态改变区域就小。此次研究结果显示，高浓度胡椒供试液能显著降低兔耳轻度冻伤后形态改变程度（p<0.01）,并且治疗结束后4/10冻耳形态与正常兔耳完全一致。
冻伤4d（治疗2d）后兔血循环中sod活力还明显低于正常，相应的脂质过氧化物mda含量明显高于正常，但胡椒供试液能显著增强血液中sod活力，减少mda的产生。冻伤6d（治疗4d）后血循环中sod活力和mda水平基本恢复正常，但冻耳组织中sod活力明显低于正常，另外mda量也明显高于正常，更有意义的是胡椒供试液能显著增加冻耳组织中sod活力并降低mda水平。由此说明，兔耳局部轻度（主要是ⅱ度）冻伤后不仅能打破受冻局部组织氧化抗氧化系统的平衡，并且因此可使全身血循环中氧化抗氧化系统受累，最终导致失衡。氧化抗氧化系统失衡的顺序为局部冻伤组织到全身血循环，而恢复的顺序则正好相反。另外实验结果也说明，冻伤局部应用胡椒70%乙醇提取液能有效增加机体抗氧化能力，抑制受冻组织氧化损伤。
兔冻耳局部胡椒供试液治疗2d和4d后血液中tnf-α水平与溶剂组相比均无明显差别，值得关注的是，治疗4d（冻伤6d）后冻耳组织中tnf-α含量显著高于溶剂组。前面已经述及在修复中、后期高浓度的tnf-α能促进组织重塑，提高修复质量，这与冻耳治疗后外观评价、组织病理及mda与sod活力测定结果相吻合。
兔足轻、重度冻伤后72h内sod活性和mda量的变化［9］、大鼠重度冻伤后72h内sod活性、mda和tnf-α含量的变化［10］国内已见报道，但冻伤后更长时间的上述指标的定量及变化还没有文献，加之冻伤后生化指标变化的研究报道数量很有限，所以药物抗冻伤的药效研究都未就冻伤后这些指标的变化进行测定。此次胡椒对兔耳轻度冻伤的作用研究中sod活性、mda和tnf-α含量变化测定结果对药物抗轻度冻伤和冻疮药效评价有一定参考价值。
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化学冻伤处理方法篇4
关键词：激光；透明带穿孔；透明带削薄；冻融小鼠卵子；受精率
theeffectsofLaserZonaDrillingandLaserZonapellucidathinningontheFertilizationRatesofmouseVitrified-thawedoocytes
RaoJin-peng，QiUFeng，QianXiao-hong，CaiYi-ting
（ReproductivemedicineCenter，theSecondaffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofmedicine，Hangzhou310052，Zhejiang，China）
abstract：objectivetoevaluatetheeffectsoflaserzonadrillingandlaserzonapellucidathinningonthefertilizationratesofmousevitrified-thawedoocytes.methodstheKunmingmousevitrified-thawedoocytesweredividedintofourgroups：thefirstthreegroupswereoccyteswithoutcumulus（Do），buttheforthgroupwereoocyteswithcumulus（CoC）.amongthethreeDogroups，thefirstoneweretreatedbylaserzonadrillingandthesecondoneweretreatedbylaserzonapellucidathinning，however，thethirdDogroupandtheCoCgroupwerenottreatedbylasershooting.alltheoocyteswithorwithoutcumuluswerefertilizedinvitroatthesametime，andthefertilizationratewerecomparedonthenextday.Resultsthefertilizationratesoffourgroupswere52.1%（25/48），25.0%（12/48），21.3%（10/47）and17.0%（8/47）respectively.thelaserzonadrillinggroup'sratesweresignificantlyhigherthantheotherthreegroups'（p0.05）.Conclusionthemethodsoflaserzonadrillingcouldimprovethefertilizationratesofmousevitrified-thawedoocytes.However，thelaserzonapellucidathinningmethodseemscouldreducethedamagecausedbylaser，butcouldnotovercometheproblemsofzonapellucidahardeningandglycoproteinhurtingduringvitrification，andcouldnotimprovefertilizationrates.
Keywords：Laser；Zonadrilling；Zonapellucidathinning；mousevitrified-thawedoocytes；Fertilizationrates
激光破膜o助孵化（Laserassistedhatching）因具有精确，快速，便捷，安全的特点，近年来已经在辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology，aRt）中广泛应用，对因胚胎冷冻造成的透明带变硬、反复着床失败患者的作用已经得到了普遍认可[1-3]。而人类卵子玻璃化冷冻技术因在生育力保存上具有重大的意义而成为近年来研究的热点。但有研究表明卵母细胞在培养过程中，不理想的体外条件会导致透明带变硬，而玻璃化冻融过程中温度的急剧变化则使得透明带硬化的现象进一步加剧，且冻融造成透明带糖蛋白损伤，使顶体反应进行困难，最终致使无法穿透透明带而受精失败[4]。本研究将激光破膜法运用到冻融小鼠卵子上，探讨激光透明带穿孔和激光透明带削薄两种方法对冻融卵子复苏后受精率的影响，为辅助生殖技术提供新的思路。
1资料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物6w龄雌性昆明系小白鼠（体重25～30g），10w龄以上成熟雄性昆明系小白鼠（体重30～35g），购自浙江中医药大学实验动物中心（动物合格证号：SYXK（浙）2013-0184）。
1.1.2药物与试剂尿促性腺激素（HmG）与绒毛膜促性腺激素（HCG）均购自丽珠制药厂，透明质酸酶（hyaluronidas）及配子处理液G-Gamete和G-iVF购自Vitrolife公司，卵子玻璃化冻融试剂盒购自origio公司，石蜡油购自SaGe公司。
1.1.3耗材与设备四孔皿购自nUnC公司，60mm培养皿及巴斯德管购自FaLCon公司，装载工具CRYotop购自KitaZato公司。激光破膜仪为德国CtaX，超净工作台为丹麦iVFteCH，解剖显微镜为日本oLYmpUS，培养箱为美国tHemRo，液氮罐为美国mVe。
1.2方法
1.2.1冻融前小鼠卵母细胞的准备雌鼠腹腔注射10iU的HmG，48h后再注射10iU的HCG，15h后将小鼠颈椎脱臼处死，用注射器于覆油的G-Gamete配子处理液中刺破输卵管膨大部，挤出成簇卵冠丘复合物（cumulus-oocytecomplexes，CoCs）。置于37℃培养箱2h后，留1/4数量的CoCs待用，剩余3/4的CoCs放入含透明质酸酶（hyaluronidas）的四孔皿内1min，再移入剩余3孔的Gamete中反复吹打至w粒细胞剥离干净，选取形态良好mii期卵母细胞于G-iVF培养液37℃、6%Co2饱和湿度培养箱内培养30min待用。
1.2.2卵母细胞玻璃化冷冻复苏冷冻：采用embryoVitriSystem-Cooling试剂盒（origio公司），冷冻液分为BS（basesolution，mHtF+12mg/mLHSa）、eS（equilibrationsolution，7.5%（v/v）DmSo+7.5%（v/v）eG）和VS（vitrificationsolution，15%（v/v）DmSo+15%（v/v）eG+0.58m蔗糖）。冷冻前将BS，eS和VS置于室温环境下平衡30min以上，分别将卵子转入BS（1min），eS（4～10min）和VS（40s）。然后将卵子以最小液滴体积2-3个/滴转移至KitaZato载体片上，迅速置入液氮中，封上套管，标记保存。解冻：采用embryoVitriSystem-warming试剂盒（origio公司），解冻液分为wS1（warmingsolution1，1m蔗糖）、wS2（warmingsolution2，0.5m蔗糖）、wS3（warmingsolution3，0.25m蔗糖）、wS4（warmingsolution1，mHtF+12mg/mlHSa）。使用前，wS1在37℃平衡30min，其他解冻液室温平衡半小时以上。将KitaZato载体从液氮中取出，迅速将前端载体片浸入wS1中，轻轻摇晃时卵子脱落到wS1中1min后，将卵子转移至wS2、wS3和wS4各3min，再转移至覆盖石蜡油的G-iVF微滴培养液（Vitrolife）中，并放入37℃、6%Co2饱和湿度培养箱继续培养。
1.2.3激光透明带穿孔或削薄穿孔：使用德国CtaX激光破膜仪，将含卵子的微滴皿移至载物台上，先于低倍镜下找到待处理的卵子，再将物镜切换至专用激光物镜上，点击激光解锁键，调节激光发射能量为2～3ms，将激光瞄准十字标定位到透明带待穿孔区域，依次点击激光发射键6～8次，直至透明带某一区域完全穿透，激光射击的位点应尽量远离极体，且保证仅作用在透明带上，不误伤卵子实体。削薄：在激光定位到透明带待削薄区域后，同样将能量调节至2～3ms，用激光将1/6周长的透明带削薄，而削薄透明带的厚度控制在50%～80%，且使得激光不完全穿透透明带。
1.2.4体外受精培养冷冻复苏后的卵子（经激光处理和未经激光处理）都需在体外进行继续培养1.5h，与此同时，处死雄鼠，剪取输精管及附睾尾取出，放入装有G-iVF的ep管中使其上游获能1h。选取形态正常的卵母细胞（大小正常，折光度好，且没有明显的胞浆溢出与皱缩）进行体外受精，调节加入的浓度，使得每个卵子周围有2～3万条，然后移至37℃、6%Co2饱和湿度培养箱培养4h后换液，继续培养过夜。
1.2.5结果统计受精后16～24h在倒置显微镜下观察受精和卵裂情况，受精率=2细胞及发育较快的3～4细胞的数量/总细胞数量。
1.3统计学方法采用SpSS19.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料采用χ2检验，p
2结果
4组冻融卵子中，激光透明带穿孔组的复苏后受精率显著高于其余3组（p0.05），见表1。
3讨论
卵子在冻融过程中，温度的急剧变化、细胞膜内外渗透压的改变、结晶和重结晶的发生以及高浓度渗透性和非渗透性保护剂的毒性作用均会对卵母细胞造成损伤，影响其后续的受精和发育过程[5]。而冷冻过程中，超低温环境还会引起透明带糖蛋白基质的改变，导致透明带变硬，这些都将影响顶体反应的进行及随后的受精结局[6]。
本研究中，分别冻融了一批经透明质酸处理后脱去颗粒细胞的小鼠卵子以及带有颗粒细胞的卵子，而复苏后的受精率分别只有21.3%和17.0%，要远低于常规体外受精获得的受精率60%～80%，这一结果也验证了冻融确实对卵子产生损伤，造成受精困难。而当我们用激光破膜法对卵子透明带进行激光穿孔处理后，其冻融后的受精率获得了显著的提高（p
孙玲等[8]使用激光透明带穿孔和激光透明带削薄技术对受精后第3d的胚胎进行辅助孵化操作，发现穿孔组的妊娠率45.8%（44/96）和着床率25.2%（68/270）均要高于削薄组的40.7%（37/91）和24.8%（58/234），这似乎也提示激光穿孔的效果要优于激光削薄。但黄绮云[9]通过对冻融胚胎进行激光透明带穿孔和激光透明带薄化却得出了截然相反的结果，在其实验中，穿孔组的种植率及妊娠率均要低于薄化组。他认为当用激光将整个透明带穿透，热效应对卵裂球产生了极大伤害，而激光削薄处理与之相比则可以最大程度上避免这一损伤，获得更好的胚胎孵出结局。但是在激光辅助孵化中，透明带的削薄只是克服了孵化前的简单机械性阻力，减低孵化过程中所消耗的能量阈值，而精卵结合的受精过程却是一个非常复杂的生物分子化学反应过程，要克服的不只是物理上的阻力[10]。
刘丽均等[7]通过免疫荧光染色技术发现小鼠卵子冻融后透明带糖蛋白-2结构受到不同程度的损伤，而糖蛋白-2上存在着精卵结合的作用位点，它的受损使得无法结合到透明带上，也无法诱发其后的顶体反应，而顶体反应是穿过透明带的先决条件[10]。因此，激光透明带削薄处理虽然克服了部分透明带冻融变硬造成的机械阻力，但其不能修复冻融对糖蛋白造成的损伤，激光处理甚至进一步破坏了糖蛋白结构，最终使得无法识别透明带上的结合位点，而一旦不能与透明带结合，也就不能穿过最后一层透明带[10]。这也解释了本研究中用激光削薄处理透明带并未取得理想结果的原因。
综上所述，在应对卵子因冻融导致的受精困难的问题时，不建议采用激光透明带削薄的方法，而应控制好激光激发的强度和位置，完全将透明带某一区域穿透，如此才能有效提高冻融卵子受精率。
参考文献：
[1]ValojerdimR，eftekhari-Yazdip，KarimianL，etal.effectoflaserzonapellucidaopeningonclinicaloutcomeofassistedreproductiontechnologyinpatientswithadvancedfemaleage，recurrentimplantationfailure，orfrozen-thawedembryos[J].FertilSteril，2008，90：84-91.
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[8]孙玲，陈士岭，李劲，等.两种不同激光辅助孵化方法对体外受精一胚胎移植妊娠结局的影响[J].广东医学，2007，28（5）：733-735.
化学冻伤处理方法篇5
冻疮是由寒冷引起的局限性皮肤炎症损害。好发生在肢体的末梢和暴露的部位，如手、足、鼻尖、耳边、耳垂和面颊部。现代医学认为冻疮是因为患者的皮肤耐寒性差，加上寒冷的侵袭，使末梢的皮肤血管收缩或发生痉挛，降低血管的通透性，导致皮肤局部血液循环障碍，使得氧和营养供给不足而发生的组织损伤。医学上根据冻疮的程度，把冻疮分四度，我们常见到的多是Ⅱ度以内的冻疮，一旦发生Ⅲ度以上的冻疮就必须去医院治疗，否则会引起组织坏死，甚至需植皮和截肢。多数人认为冻疮是由于隆冬季节天寒地冻造成的。其实，初冬或早春时，更容易发生冻疮。除了冷，鞋袜潮湿、鞋过小过紧、过度疲劳、活动少也是冻疮的诱发原因。
冻疮常常出现在秋末冬初或冬末春初，如果宝宝前一个冬季患过冻疮的话，在第二年的冬天患冻疮的几率也会很高。得了冻疮以后，在寒冷的冬天很难治愈，所以预防是第一位的。为了防止宝宝一整个冬天都被冻疮烦扰，父母们应该提前做好预防措施，避免宝宝生冻疮。
不要等到天气寒冷的时候再想到做保暖工作，在每年初冬天气刚冷起来后，就要给宝宝戴好帽子和手套，尤其是在户外的时候。耳朵和手脚是最容易长冻疮的部位，需要特别加以保暖。
临睡前，跟宝宝一起用热水泡泡手和脚，能够促进手部和脚部血液循环。需要注意的是宝宝的皮肤比较娇嫩，水温不能过热，避免烫伤宝宝。
在秋季就应当增加宝宝的体育活动，如走路，在室外玩耍，并利用每天洗手、脸、脚的间隙，轻轻揉擦皮肤，至微热为止，以促进皮肤的血液循环，提高皮肤的耐寒能力。还应做到勤活动、勤换鞋袜、勤洗脚、勤擦耳鼻，不穿潮湿或过小、过紧的鞋袜。
物理治疗法――保暖和按摩法
在冻疮刚发生的时候，就应该及时处理。保暖法可以治疗和控制早期Ⅱ度以内的冻疮。冻疮的患处一定要保暖，没有出现水泡的患处，可以用揉法、摩法、擦法等在患处的局部进行操作，时间为5～10分钟。要轻快柔和，切忌生硬粗暴。如果局部发生了水疱或溃疡，在操作时要避开该破溃部，先在其四周操作，待局部溃疡愈合、血脉流通后，再进行操作。
冻疮发生时，家长看到宝宝难过的样子非常着急，想尽快帮宝宝缓解痛痒症状。肝素冻疮膏效果比较好。
肝素冻疮膏肝素冻疮膏系肝素钠与维生素e组成的复方制剂。肝素具有抗凝作用，可降低局部血液黏度，配合维生素e治疗冻疮，有不错的疗效。
有些常用的中成药，虽然这些不一定是专门对付冻疮的，却在治疗冻疮方面“宝刀不老”。
七厘散七厘散本来作用是化瘀消肿，止痛止血，常用于跌打损伤。但其实它也可以用于治疗冻疮。
取七厘散适量，加白酒少许，调成稀糊状，摊在消毒纱布上，敷贴于患处。每天早晚各换药1次，连续用药3～5天，就能消除红肿硬结，使冻疮痊愈。
跌打丸顾名思义，治疗跌打损伤。但它同样适合治疗未溃冻疮。
取跌打丸3-5粒，捣碎，用白酒少许，调成稀糊状，外敷患处，用纱布覆盖，胶布固定住。每天早晚各换药1次，连续用药3～5天，就会发现红肿和硬结消退了。
云南白药大家都知道，云南白药是治疗跌打损伤、创伤出血的好药，但其实，它也可以治疗已经溃疡的冻疮。
取云南白药粉末适量，撒在冻疮溃烂处，一天上3次药，连用5～7天，就能见效。
一看名字就知道，此药是专门用来对付冻疮的。此药用途范围广，对由冻疮引起的红肿、疼痛、痒、干裂、溃疡，都有很好效果。方法：使用前，用温开水加少量食盐将宝宝冻疮的位置浸泡15～20分钟，然后擦干，取蛇油冻疮膏均匀涂于患处，轻轻揉2-3分钟，每天4次。
果蔬治疗法
其实，对付冻疮，有时并不一定要用药，我们生活中常见的蔬菜水果等，都可以在治疗宝宝冻疮方面助妈妈一臂之力。
用白葱根、茄根各100克，煎水涂洗患处，每日1～2次。涂洗数次就可以见效。
用香蕉皮搓手足易患冻疮的部位，早晚各一次，不仅能预防冻疮，对皮肤还有护理的功效。
化学冻伤处理方法篇6
[基金项目]国家自然科学基金项目（81674168）；四川省科学支撑项目（2011FZ0053）；四川省应用基础研究项目（2012JY0027）
[通信作者]*顾健，教授，研究生导师，主要从事中药及民族药物开发与研究，tel：13882156288，e-mail：
[作者简介]张鑫，硕士研究生，e-mail：
[摘要]该文研究了波棱素（herpetin，Hpt）脂质体冻干粉针剂的制备方法，并对其初步安全性和药效学进行评价。采用薄膜分散法制备Hpt脂质体溶液，以包封率、粒径等为评价指标，筛选最佳冻干保护剂；对冻干粉针进行稳定影响因素实验，并初步研究了Hpt脂质体冻干粉针的安全性以及对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果。质量分数5%乳糖+5%蔗糖为最佳冻干保护剂，按照最优处方制得的脂质体冻干粉针复水后，平均包封率为（99.70±0.50）%，平均粒径为（107.0±1.2）nm，平均电位为（-6.11±0.72）；脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均较为敏感；脂质体冻干粉针复水后不会引起溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响；Hpt脂质体对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果明显，血清丙氨酸氨基转移酶（aLt）、天门冬氨酸氨基转移酶（aSt）、碱性磷酸酶（aLp）指标水平均明显改善，治疗效果明显优于Hpt原药。按照最优处方制备的波棱素脂质体冻干粉复水后粒径均匀，包封率符合《中国药典》要求，且具有较高的安全性，能显著提高Hpt的治疗效果，保存时应该注意低温、避光、密封保存。
[关键词]波棱素；脂质体；粉针剂；安全性；药效学
波棱素（herpetin，Hpt）是从藏药波棱瓜Herpetospermumcaudigerumwall.子中的木脂素分离出来的活性单体成分。药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[1]。但Hpt的水溶性很差，口服生物利用度低，为了克服Hpt的上述缺点，并增强其治疗肝脏疾病的效果，作者在前期研究中利用薄膜蒸发法制备Hpt脂质体。本研究进一步对Hpt脂质体冻干粉针制剂进行筛选，并初步考察了Hpt脂质体冻干粉针的安全性及对肝损伤模型动物的治疗效果。
1材料
acquity型超高效液相色谱（美国，waters）；ZS90激光粒度仪（英国，malvern）；冷冻干燥机；LHH药品稳定性试验箱（上海一恒科学仪器有限公司）；可见分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司）；台式高速离心机tGL-16G（无锡市瑞江分析仪器有限公司）。波棱素对照品（自制，纯度为98.59%）；波棱素原料药（自制，纯度>95%）；大豆卵磷脂购自德国Lipoid公司；胆固醇购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶（aLt）、天门冬氨酸氨基转移酶（aSt）、碱性磷酸酶（aLp）试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超滤离心管（10kDa）购自millpore公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。
iCR小鼠，SpF级，体重18～22g，雄性；家兔，体重1.8～2.2kg，雄性，均购自于成都达硕实验动物研究中心，动物合格证号分别为SCXK（川）2013-24，SCXK（川）2013-14。
2方法与结果
2.1Hpt脂质体溶液的制备
根据前期研究结果，采用薄膜分散法制备Hpt脂质体溶液[2]：称取波棱素单体24.4mg、胆固醇195.1mg、大豆磷脂780.5mg，置于圆底烧瓶中，加入100mL氯仿溶解，水浴减压除去氯仿，成膜，加入0.5%泊洛沙姆F6850mL脱膜，将得到的类脂膜初悬液水浴超声20min，过0.22μm滤膜，即得Hpt脂质体溶液。经测定，Hpt脂质体平均包封率（94.50±2.15）%，平均粒径（119.2±10.7）nm，多分散系数为0.156±0.075。
2.2冻干粉针处方筛选
选择常用的葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖为冻干保护剂选择不同种类、不同浓度的冻干保护剂，见表1，溶于Hpt脂质体溶液中，冷冻干燥后，制得Hpt脂质体冻干粉针，观察以下评价指标：①外观及色泽；②再分散性；③粒径；④包封率，筛选出适合的冻干保护剂。选择5%乳糖+5%蔗糖作为复合冻干保护剂，Hpt脂质体复水后，粒径最小，包封率最高，外观和再分散性也较好，故选择5%乳糖+5%蔗糖作为Hpt脂质体的冻干保护剂。
2.3初步稳定性研究
取Hpt脂质体冻干粉针样品进行影响因素实验考察，分别选取①高温试验条件：40℃；②高湿试验条件：相对湿度（RH）75%；③光照试验条件：4500lx的光照。将冻干粉针样品分别放置上述条件下，于第5，10天取出样品，观察Hpt脂质体冻干粉针变化情况，测定渗漏率，见表2，在40℃条件下放置后，Hpt脂质体冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率增加，含量略降低；在相对湿度75%的高湿条件下放置后，Hpt脂质体冻干粉针外观塌陷，再分散困难，脂质体泄漏率增加；在强光条件下放置后，冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率亦增加，含量亦明显降低。因此，Hpt脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均敏感，应低温、密封、避光保存。
2.4溶血试验
取家兔血液10mL置于含有枸橼酸葡萄糖抗凝的离心管中，4000r・min-1离心5min，弃去上清液，下层红细胞用生理盐水洗涤3次，并按体积比用生理盐水稀释成2%红细胞混悬液。所有试管中均加入红细胞混悬液各2.5mL，设置样品管、阴性对照试管和阳性对照试管[3]。样品管中分别加入适量Hpt脂质体冻干粉针复水液及适量生理盐水，使之Hpt脂质体终浓度分别为2%，4%，6%；阴性对照试管仅加入生理盐水；阳性对照试管加入蒸馏水。混匀后，立即将试管置于37℃恒温水浴箱水浴30min后，取出适量样品液离心去除不溶物，于542nm下测定各样品吸光度，计算溶血率，见表3，Hpt脂质体在各个测定浓度下的溶血率均低于5%，可判断Hpt脂质体无溶血作用。
2.5全血凝血时间
取波棱素脂质体冻干粉针复水液10μL，以等量生理盐水作为对照，加入24孔细胞培养板中。另取枸橼酸葡萄糖抗凝家兔血适量，按体积比10∶1加入0.1mol・L-1CaCl2溶液进行活化，混匀，立即各取100μL加入上述含有样品的培养板中，分别于5，15，25，35，45，55min时间点加入3mL37℃预热的蒸馏水于对应的样品孔中。5min后取出适量样品液离心去除不溶物，于542nm下测定各样品光密度值。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制全血凝固时间曲线，见图1，Hpt脂质体冻干粉针复水液样品的全血动态凝血曲线与对照组相似，可知Hpt脂质体对全血凝固时间无显著影响。
2.6血管刺激试验
取雄性家兔1只，每日右耳耳缘静脉注射Hpt脂质体复水液20.0mg・kg-1，左耳耳缘静脉注射生理盐水注射液，作为空白对照组，每天1次，连续滴注4d。末次给药后24h，耳缘静脉注入空气处死家兔，剪取距注射部位1.3cm处兔耳，置于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，He染色。光镜下观察药物对兔耳血管的刺激性反应，结果见图2，连续注射Hpt脂质体后，耳缘静脉血管内皮完整，内皮细胞结构清楚，血管腔无扩张，无坏死脱落，未见明显炎细胞浸润，可判断Hpt脂质体冻干粉针对血管无刺激性。
2.7Hpt脂质体冻干粉针对四氯化碳致肝损伤的保护作用
2.7.1动物分组造模及给药iCR小鼠50只，雄性，18～22g。采用随机数字法将小鼠分成5组：正常组、模型组、Hpt对照组、阳性对照组、治疗组，每组10只小鼠。Hpt对照组尾静脉注射20mg・kg-1的Hpt10%甘油生理盐水溶液（相当于0.4g・L-1的Hpt）；阳性对照组尾静脉注射20mg・kg-1清开灵注射液；治疗组尾静脉注射20mL・kg-1的Hpt脂质体原药溶液，正常组和模型组注射等体积生理盐水，均每天1次，连续给药7d。末次给药后1h，除空白组，其余各组腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液20mL・kg-1，造成急性肝损伤模型[4]。
2.7.2指标测定及评价腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液后，禁食不禁水16h后，摘眼球取血，血样室温静置30min，4℃4000r・min-1离心10min后，分离血清，备用。按试剂盒测定说明书分别测定血清丙氨酸氨基转移酶（aLt）、天门冬氨酸氨基转移酶（aSt）、碱性磷酸酶（aLp）的活力，结果见表4。正常组小鼠血清中的aSt，aLt，aLp活力明显低于模型组（p
3讨论
脂质体混悬液物理化学性质不稳定，不利于储存和运输，故制备成冻干粉针。制成冻干粉针的过程中，零下的温度会造成磷脂双分子层的破裂，加入的蔗糖和乳糖属于糖类大分子，能在脂质体混悬液中形成无形的骨架，能够起到冻干保护剂的作用，从而维持磷脂双分子的稳定。但受到本身原料的限制，冻干粉针也不能长时间处于高温、高湿和光照的环境。初步安全性实验结果表明，波棱素脂质体冻干粉针未造成家兔的溶血和凝血，对注射部位也没有明显的刺激反应。因此，所制备的波棱素脂质体冻干粉是安全可靠的，为今后可能的临床应用奠定了安全数据基础。
aLt，aSt和aLp是自身免疫活性酶，主要存在于心肌、肝脏，血液中含量很低，当肝脏受到破坏时，才会在血液中急剧上升。CCl4致急性肝损伤是一种肝脏造模的经典方法，其原理在于CCl4其强氧化的自由基破坏肝脏细胞膜，从而导致其中的aLt，aSt和aLp从肝脏流入血液。本实验结果表明Hpt脂质体能较阳性组和Hpt原药组，显著降低小鼠血清中aLt，aSt和aLp水平，这表明其对肝损伤有明显的保护作用。这应该与脂质体制剂本身具有肝脏靶向性有关，能够富集Hpt在肝脏部位，增强Hpt清除强氧化自由基的效果。本研究为Hpt脂质体保护急性肝损伤疾病提供实验依据，具有临床指导意义。
[参考文献]
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化学冻伤处理方法篇7
1临床资料和方法
1.1一般资料:58例均为我科诊治的增生性患者,其中女32例,男26例,年龄2～12岁。瘢痕产生的原因:手术后瘢痕8例,外伤后瘢痕21例,烧烫伤后瘢痕26例,预防接种后瘢痕3例;皮损部位:胸前区8例,颈部9例,其次为背部、面部、四肢等处,共41例;皮损大小:直径4cm者4例。58例患儿均无其他临床疾病及传染病,3个月内未进行过任何治疗。采用随机对照法将58例患儿随机分为治疗组30例,对照组28例,两组在年龄、性别、瘢痕大小,皮损情况,病程长短等方面经统计学处理无显著性差异,具有可比性。
1.2治疗方法:治疗组:30例,采用冷冻联合苯海拉明瘢痕内注射。首先用液氮冷冻治疗,用无菌棉签蘸取液氮后压迫于瘢痕之上,直至瘢痕颜色变白时停止冷冻(10～25s),冷冻时间与瘢痕的厚度呈正相关,即瘢痕越厚,压力越大,时间越长,反复数次(4～6个冻融循环),瘢痕较大者可分区分片进行冷冻。冷冻约30min后瘢痕表皮即有水疱,瘢痕组织四周会出现反应性血管充盈区,24h左右术区水疱渗出量达到高峰,可每天用碘伏涂擦水疱及周围皮肤,水疱较大者可用无菌针头放出渗液,保留表皮,可反复放液,无须包扎,注意保持局部清洁干燥,待逐渐干涸结痂并于10天后脱落,触摸瘢痕,如质地较软,可进行下一步注射治疗,如瘢痕较硬,可再次冷冻,直至瘢痕变软后再进行注射治疗。具体为:取苯海拉明20mg(河南新乡常乐制药有限公司生产),常规消毒瘢痕及周围皮肤,用1ml无菌注射器抽取药液行瘢痕内注射,针尖斜面应向上,注射至瘢痕刚发白为止,一次注射总量儿童不宜超过40mg,15～30min后观察有无过敏反应发生。1周注射1次,一般4次为一个疗程。
对照组:28例,单独采用液氮冷冻治疗,其方法同治疗组。
1.3疗效判断标准[1]:治愈:疼痛、瘙痒等症状消失,瘢痕完全软化变平、触之柔软,无硬结或条索状,治疗后12个月无复发;显效:疼痛、瘙痒等症状消失或基本消失,瘢痕中有60.0%～70.0%的部分软化变平,瘢痕由重变轻,治疗后12个月无复发;无效:疼痛、瘙痒等症状稍有减轻或无变化,瘢痕质地、大小仅有轻微变化或没有变化,治疗完成后12个月后又复发。总有效率以痊愈加显效计。
2结果
治疗组30例,治愈14例,总有效率93.3%;对照组28例,治愈9例,总有效率71.4%,两组总有效率比较差异有显著性(χ2=4.87,p
3讨论
瘢痕形成是创伤修复的一种必然结果,但过度修复会导致病理性瘢痕的形成,引起外形的毁损和程度不等的功能障碍。国内外对瘢痕的治疗有手术、药物、压力、激光、放射等多种疗法,但是复发率仍很高,有些方法并发症很多,不适合儿童。研究表明,单一疗法往往很难有效控制病理性瘢痕的发展,只有采取综合治疗,才可望在瘢痕防治上取得突破和显著疗效[2]。由于单一疗法的复发率较高,故多采用两种或两种以上方法联合治疗,如药物注射联合放射、药物治疗联合激光,以及外科手术后联合激光或药物治疗等[3-5],我科近两年采用冷冻联合苯海拉明瘢痕内注射治疗儿童增生性瘢痕,效果良好。
液氮冷冻治疗增生性瘢痕是一种物理疗法,安全有效、无副作用,尤其适合儿童增生性瘢痕的治疗。它可通过超低温,导致细胞脱水,皱缩和活细胞萎缩,迅速使受冻细胞死亡,瘢痕因低温导致组织坏死,结痂脱落后明显变平、软化,自觉症状消失。冷冻的超低温还能使皮肤角质层与生长层松懈,胶原纤维变性从而抑制成纤维细胞生长。Dalkowski等[6]冷冻处理体外培养的瘢痕成纤维细胞,发现低温对细胞增殖无明显影响,而机械作用可使细胞产生致命性的破坏,Ⅲ型胶原的合成减少,Ⅱ/i型胶原的比率增加,同时成纤维细胞tenascin-C减少,为冷冻治疗瘢痕提供了理论依据。冷冻治疗主要不良反应为水疱形成、伤口愈合延迟、色素脱失或色素沉着等。研究表明冻融时间大于25s通常会引起黑素细胞的破坏,继发色素减退,特别是Ⅳ～Ⅵ型皮肤的人,冻融时间在15～20s则不易引起色素减退,但需多次治疗[7]。冷冻治疗应严格掌握冻融时间和频率，避免不良反应发生。对面积较大的瘢痕需分区分片进行冷冻并配合药物注射综合治疗。
苯海拉明为抗组胺药物，有文献报道在瘢痕的成纤维细胞培养基中加入苯海拉明，发现它能有效抑制成纤维细胞的生长。此外，免疫学研究证明，瘢痕的发病机理中有免疫因素参与，苯海拉明能有效抑制此类免疫反应，从而起到治疗瘢痕及止痒作用。苯海拉明还有阻滞周围神经传导的作用，可以作为局部麻醉剂使用，减轻了药物注入瘢痕时导致的剧烈疼痛，无需在注射液中另加利多卡因，且副作用小，对不适合注射激素的儿童尤为适用，可以减少许多并发症。因瘢痕组织较为致密，单独注射药物阻力大、疼痛，患儿很难配合，先冷冻即可抑制成纤维细胞的生长，又可使瘢痕变薄变软，瘢痕变薄变软后再配合苯海拉明药物注射，缩短了治疗周期，减少了单独冷冻、单独药物注射引起的不良反应。
冷冻联合苯海拉明瘢痕内注射综合治疗儿童增生性瘢痕，设备简单，操作方便，安全性高，未发现有明显副作用。
[参考文献]
[1]孟凡军,张学诚,赵月荣.瘢痕内切除瘢痕瓣回植联合药物注射治疗瘢痕疙瘩[J].中国美容医
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化学冻伤处理方法篇8
关键词：园林植物生长；极端温度灾害；防御
一、寒潮
1.寒潮的危害。寒潮是指大规模冷空气（在气压场上为冷高压）由亚洲大陆西部或西北部侵袭中国时所经过的地区出现剧烈降温、大风、霜冻、雨雪等灾害性天气的过程。北方冷空气入侵造成24小时内降温10℃，并且过程最低气温达5℃以下。寒潮天气急剧降温会使植物遭受严重冻害。尤其是晚春时节，天气逐渐转暖，万物苏醒，植物开始萌芽、生长，一旦有强大的寒潮暴发南下，常使幼嫩的植物遭受霜冻危害。另外，春季寒潮引起的大风，常给北方带来风沙天气，中国南方，寒潮天气除降温外，还有降水，尤其是在华南的地区，常有大范围较大阴雨天气。
2.寒潮的防御。寒潮到来之前，可采用加覆盖物、设风障、搭拱棚等方法保护育苗地，对越冬园林植物选择优良品种，提高抗冻能力；加强冬前管理，如采取增施磷钾肥、镇压等措施：提高植株抗冻能力；改善小气候生态条件，如苗圃地越冬期间可采用冬灌、镇压、覆粪或覆土等措施，改善小气候生态环境，达到防御寒潮的目的。
二、霜冻
1.霜冻的危害。霜冻是在平均温度0℃以上的温暖季节里。霜冻对园林植物的危害，主要是使植物组织细胞中的水分结冰，导致生理干旱，而使其受到损伤或死亡，给园林生产造成巨大损失。遭受霜冻后，植物不一定都会被冻死，当霜冻不严重时，温度回升后，可通过缓慢的解冻而恢复生命力，但如霜冻后太阳辐射强烈，气温急剧上升，会使细胞间的冰晶迅速融化成水，而这些水分在还未被细胞逐渐吸收前就大量蒸发，这样就会造成植物枯萎，甚至引起死亡。因此，霜冻强度越大，降温后天气越晴朗、气温回升越急剧，对植物危害越大，越容易造成植株死亡。
2.霜冻的防御。（1）生产技术措施。1）合理安排播种期和移栽期，对不同品种的苗木合理布局。如采取霜前播种，霜后出苗等技术措施，尽量避开霜冻的危害。2）选择合适的地段，适地适树。如三面环山、开口朝南的地形，在山坡中部和靠近水边的地方，霜害较轻，可种植抗寒能力较弱的苗木，从南方引种到北方的苗木，尽量栽植在山坡中段，避开霜冻危害，以提高引种的成功率；南坡或北面有挡风的障碍物等地形，可以种植抗寒能力弱的树种。3）混合施肥。特别是在冬前增施磷钾肥，可以提高园林植物的抗寒能力。4）培育抗寒性能强的植物品种，这是最根本的提高植物抗霜冻能力的方法。（2）物理抗霜措施。1）熏烟法。是用能够产生大量烟雾的柴草、牛粪、锯木、废机油、赤磷或其他尘烟物质，在霜冻来临前半小时或1小时点燃。这些烟雾能够阻挡地面热量的散失，它的增温效应在于燃烧烟堆形成烟雾，可以阻挡地面辐射，增加大气逆辐射，使地面有效辐射减弱，地面温度不致降得很低；同时形成烟雾时会因燃烧而产牛大量热量，使近地面的空气温度升高；烟雾里有许多吸湿性烟粒，可以充当凝结核，吸收空气中的水汽，促进水汽凝结，并放出大量潜热，也能提高近地面空气温度。据试验，一般熏烟能提高温度1℃～2℃左右。但这种方法要具备一定的天气条件：只适用于无风或微风的天气情况，风太大时熏烟效果很差，且成本较高，污染大气，不适应于普遍推广，只适用于短时霜冻的防止和在名贵林木及其苗圃上使用。2）灌溉法。在霜冻来临前的l～2d灌水，通常灌水后可使温度升高2℃～3℃，持续时间为2～3d。至于小面积的园林植物还可以采用喷水法，其方法是在霜冻来临前1小时，利用喷灌设备对植物不断喷水。3）覆盖法。将塑料薄膜、芦苇、秸秆、草木灰、稻草、土杂肥等覆盖物覆盖在植物表面，以减少地面辐射，同时使被保护植物与外界隔离，温度降低较少，即可达到防御霜冻的目的。对于经济价值高的树木可用稻草包裹树干，根部堆草或培土10cm～15cm也可防御霜冻。有些矮秆苗木植物，还可用土埋的办法，使其不致遭到冻害。4）施肥法。在寒潮来临前早施有机肥，特别是用半腐熟的有机肥做基肥，可改善土壤结构，增强其吸热保暖的性能。也可利用半腐熟的有机肥在继续腐熟的过程中散发出热量，提高土温。入冬后可用暖性肥料壅培林木植物，有明显的防冻效果。暖性肥料常用的有厩肥、堆肥和草木灰等。这种方法简单易行，但要掌握好本地的气候规律，应在霜冻来临前3～4天施用。入冬后，可用石灰水将树木、果树的树干刷白，以减少散热。5）直接加热法。用加热器直接加热空气以升高温度，多用于苗圃防霜冻。通常采用煤油、天然气等燃料，也可用红外线加热器来加热提高温度，达到防御霜冻的目的。6）空气混合法。霜冻发生时，空气大多处于静稳状态，近地面空气层温度低，上层空气温度高，此时，使用安装在高塔上的马达驱动大型螺旋桨或鼓风机，将近地层空气不断上下混合，可防御霜冻的发生。
三、冻害
1.冻害的危害。（1）细胞间隙结冰伤害：当环境温度缓慢降低，使植物组织内温度降到冰点以下，细胞间隙的水开始结冰，即胞间结冰。胞间结冰不一定使植物死亡，大多数植物胞间结冰后经缓慢解冻仍能恢复正常生长。（2）细胞内结冰伤害：当环境温度骤然降低时，不仅细胞间隙结冰，细胞内也会同时结冰。细胞内冰晶体积小，数量多，它们的形成会对生物膜、细胞器和基质结构造成不可逆的机械伤害。原生质结构的破坏必然导致代谢紊乱和细胞死亡。
2.冻害的防御。（1）根据当地温度条件，选用抗寒品种，并确定不同作物的种植北界和海拔上限。（2）栽培措施：越冬作物播种适时、播种深度适宜、北界附近实施沟播和适时浇灌冻水，果树夏季适时摘心、秋季控制灌水、冬前修剪等。（3）农业技术措施：在一定程度上也能提高植物抗寒性，如培育壮苗、增施磷钾肥、浇冻水、地面覆盖等。（4）用植物生长调节剂处理植物，可以提高植物的抗逆性。如植物生长延缓剂amo-1618、多效唑广泛用于果树，这些生长延缓剂能抑制Ga的合成，提高树木的抗寒性。用矮壮素处理小麦、水稻、油菜等可以提高其抗寒性。
四、冷害
1.冷害的危害。（1）光合作用减弱：低温使叶绿素生物合成受阻，冷害叶片发生缺绿或黄化；各种光合酶活性受到抑制，如果伴有阴雨、光照不足则光合速率下降更多。（2）呼吸代谢失调：冷害使植物的呼吸速率大起大落，即先升高后降低。（3）根系吸收能力下降：低温下根系生长减慢，吸收面积减少，呼吸减弱，供能不足，使植物体内矿质元素的吸收与分配受到限制，水分平衡遭到破坏，失水大于吸水，导致植株萎蔫、干枯。（4）代谢紊乱：植物受冷害后，水解酶类活性常常高于合成酶类活性，物质分解加速，表现为蛋白质含量减少，可溶性氮化物含量增加，淀粉可溶糖含活性氧清除系统活性下降，活性氧积累，引发膜脂过氧化伤害。
2.冷害的防御。（1）培育植物抗冷品种。（2）根据当地气候条件，确定适合的作物品种和播栽期，以便在低温敏感期避开有害低温。（3）低温锻炼。低温锻炼是提高植物抗冷性的一种有效途径。许多植物如预先给予适当的低温处理，尔后即可忍受更低温度而不致受害。如春季采用温室、温床育苗，在露天移栽前，必须先降低室温或床温至10℃左右，保持1～2天，移入大田后即可抗3℃～5℃的低温。（4）调节农田小气候。利用塑料薄膜温床育苗移栽，既可克服春季低温危害，又能使作物提早成熟，避开秋季低温。在低温来临之前，灌水或喷洒保墒剂等常可改善近地层温度状况。（5）合理施肥。低温到来之前，合理调整施肥种类，适当增施磷、钾肥，少施或不施速效氮肥，有助于提高植物抗冷性。（6）化学诱导。脱落酸、细胞分裂素、2，4-D、油菜素内酯等均能提高植物的抗冷性，如在水稻苗期，用10mg·L-1油菜素内酯浸根24小时，可增强秧苗抵抗低温能力，有利培育壮秧。玉米、棉花种子播前用福美双（tmtD）处理也可提高幼苗抗冷性。
五、热害
1.热害的危害。高温胁迫引起植物的伤害称热害。植物受高温危害后，因体内蛋白质变性、代谢性饥饿、有毒物质积累以及生理活性物质缺乏会造成直接和间接的危害，出现各种热害病症：叶片出现明显的水渍状烫伤斑点，随后变褐，坏死，叶绿素破坏严重，叶色变为褐黄；木本植物树干（尤其是向阳部分）干燥、裂开；出现雄性不育，花序或子房脱落等异常现象。中国西北和南方地区有时太阳猛烈曝晒，西北、华北地区有时吹干热风，都会使植物严重受害。向阳果实和树干常出现的“日灼病”，是由于局部温度快速升高引起的一种热害。
2.热害的防御。（1）培育抗热品种。（2）高温锻炼：一般是将萌动的种子，在适当高温下锻炼一定时间再播种。高温时植物体内蛋白质合成发生变化，诱发一些热稳定蛋白质合成，提高植物的抗热性。（3）改善栽培技术也可以提高植物的抗热性，如合理灌溉，增加小气候湿度，促进蒸腾，有利于降温；采用高秆与矮秆、耐热作物与不耐热作物间作套种，人工遮荫；少施n肥等都是有效的措施。（4）化学制剂处理：喷洒CaCl2、ZnSo4、KH2po4等可增加生物膜的热稳定性；施用生长素、激动素等生理活性物质，能防止高温造成损伤。
参考文献
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[2]宋志伟.园林生态与环境保护[m].北京：中国农业大学出版社，2008.
化学冻伤处理方法篇9
【关键词】熊胆冻干粉针剂，；，，安全性实验，，
摘要：目的对熊胆冻干粉针剂进行肌肉刺激性、血管刺激性、全身过敏性及溶血性实验，以评价其用药的安全性。方法在肌肉刺激性实验中，主要观察2只家兔注射熊胆冻干粉针剂后48h的变化。在血管刺激性实验中，主要观察2只家兔分别连续5d注射熊胆冻干粉针剂及生理盐水的变化。在全身过敏性实验中，6只豚鼠隔日3次腹腔注射熊胆冻干粉针剂，于首次给药后第14日和21日分别静脉注射熊胆冻干粉针剂，观察15min内动物的变化。在溶血性实验中，观察本品在4h内有无溶血和聚集现象。结果熊胆冻干粉针剂对家兔股四头肌无刺激作用，对家兔耳缘静脉无刺激作用，对豚鼠未见过敏反应，家兔无溶血现象。结论熊胆冻干粉针剂的动物实验结果表明其安全可靠。
关键词：熊胆冻干粉针剂；安全性实验
thetestReportoftheReliabilityofBearGallLyophilizedpowderforinjection
abstract：objectivetoevaluatethereliabilityofbeargalllyophilizedpowderinjectionbytestingthemusclestimulation，vesselstimulation，hypersensitivityoftotalbobyandhaemolytictest.methodsinthemusclestimulationtest，tworabbitswereobservedat48hafterinjectionbeargalllyophilizedpowder;inthevesselstimulation，tworabbitswereobservedonthe5dafterinjectionbeargalllyophilizedpowderorsaline，respectively;inhypersensitivityoftotalboby，6cavieswereinjectedbybeargalllyophilizedpowderinabdominalcavityin3times，andthelasttwowere14dand21dafterfirstmedication;inthehaemolytictest，hemolysisandcoagulationweremainlyobserved.Resultsthebeargalllyophilizedpowderhasnostimulationtomuscleandearveinofrabbit，therabbitshavenoallergicreactionascontrastandwithouthemolyticreaction.ConclusionBeargalllyophilizedpowderinjectionissafeandreliablebasedontheanimalexperiment.
Keywords：Beargalllyophilizedpowderforinjection;Reliabilitytest
熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的干燥胆，气微清香或微腥，味极苦而回甜，具有清热、镇惊、利胆等药理作用。引流熊胆和天然熊胆一样，主要含有胆酸，熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸。熊胆注射剂以引流熊胆为原料而制成的冻干粉针剂，其主要成分是熊去氧胆酸。为探讨熊胆冻干粉针剂的临床用药安全，我们对熊胆冻干粉针剂进行了安全性实验，现将实验内容及结果报道如下。
1药物
熊胆冻干粉针剂由延边大学药学院天然药物教研室提供，临用时取本品。
2方法
2.1局部刺激性实验
2.1.1目的本实验主要观察熊胆冻干粉针剂对家兔股四头肌的刺激性反应。
2.1.2动物日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0~2.5kg，由延边大学医学院实验动物科提供。
2.1.3方法取健康无损伤的家兔2只，以无菌操作法分别在其左右两腿股四头肌内各注入供试品1.0ml/只，注射后48h处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位局部刺激反应，按表1换算成相应的反应级。
2.1.4结果实验结果表明：两只家兔经肌肉注射后，家兔健康正常，腿部活动正常。家兔处死取出股四头肌后，肉眼观察给药部位，给予熊胆冻干粉针剂的4例股四头肌刺激反应级数各为0级，提示本品对家兔股四头肌无刺激作用。
2.2血管刺激性实验
2.2.1目的本实验主要观察熊胆冻干粉针剂对家兔血管的刺激性反应。
2.2.2动物日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0～2.5kg，由延边大学医学院实验动物科提供。
表1注射肌肉刺激反应评级标准（略）
2.2.3方法取健康、两耳无损伤的家兔2只。用无菌操作方法于左耳耳缘静脉注射灭菌生理盐水2.3ml/kg，于右耳耳缘静脉注射熊胆冻干粉针剂的浓缩液2.3ml/kg，1次/d，连续3d。于末次注射24h后将动物放血处死，分别距注射部位进针点2cm处向心端剪下耳缘约2cm作为标本，标本用福尔马林固定，常规组织切片，观察血管周围变化、血管壁是否损伤、内皮细胞有无脱落、有无血栓形成以及其他病理变化。
2.2.4结果实验结果表明：家兔左右耳肉眼观察注射部位均无异常，血管无充血，周围组织无水肿现象。病理切片观察结果表明，给予生理盐水的2例耳缘和给予熊胆冻干粉针剂的4例耳缘均未见血管扩张和炎细胞浸润，提示本品对家兔血管无刺激作用。
2.3过敏实验
2.3.1目的本实验主要观察熊胆冻干粉针剂对豚鼠有无全身过敏性反应。
2.3.2动物健康无伤豚鼠，雄性，由延边大学医学院实验动物科提供。
2.3.3方法取健康无伤豚鼠6只，体重250～350g，隔日腹腔注射供试品0.5ml，连续3次，然后分为2组，每组3只，分别在第1次注射后14d及21d静脉注射本品1ml进行攻击，在注射后15min内观察动物反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者，或有音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者为阳性。
2.3.4结果实验结果表明：熊胆冻干粉针剂于第1次腹腔注射后第14天和第21天进行攻击，均未发生过敏反应。表明在本次实验条件下，熊胆冻干粉针剂对豚鼠无全身性致敏作用。结果见表2。
表2不同时间过敏实验观察结果（略）
“-”表示为阴性结果；“+”表示为阳性结果
2.4溶血性实验
2.4.1目的本实验观察熊胆冻干粉针剂有无溶血性反应。
2.4.2动物日本大耳白家兔，雄性，体重2.3kg，由延边大学医学院实验动物科提供。
2.4.3方法取健康家兔1只，从颈总动脉取血约10ml，放置于200ml三角瓶中，用玻璃棒搅动血液10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，加约10倍量的生理盐水，摇匀，离心（2000r/min，5min）除去上清液，沉淀的红血球再用生理盐水按如法洗涤2~3次，至上清液不显红色为止。取沉淀的红细胞1ml，加生理盐水50ml，制得2%的兔红细胞混悬液。取试管7支，按表3配比量依次加入2%兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温水浴箱30min，然后分别加入不同量的上述药液（第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管），摇匀，置37℃恒温水浴箱中。开始每隔15min观察1次，1h后，观察1次/h，共4次。结果见表3。
表3溶血实验配比量（略）
2.4.4溶血判定标准溶液澄明红色，管底无细胞残留，为全溶血；溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留，为部分溶血；红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，为无溶血；虽无溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不分散为凝集。
2.4.5结果熊胆冻干粉针剂提取物无溶血和凝集反应，结果见表4。
表4各种时段溶血实验结果观察（略）
"-"表示无溶血或凝集反应，"+"表示有溶血或凝集反应
3结论
化学冻伤处理方法篇10
【摘要】目的探讨化学去细胞肌肉支架移植后对大鼠损伤脊髓轴突再生的促进作用。方法将24只成年雄性大鼠制成脊髓半横断损伤模型后，脊髓缺损处分别植入化学去细胞肌肉、冻融去细胞肌肉和新鲜肌肉，空白组不做处理。术后4周，银染观察脊髓轴突的再生情况，对移植物中再生轴突进行计数，做统计学分析并用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维。另取6只化学去细胞肌肉治疗的模型鼠分别行HRp顺行和逆行示踪，1周后观察脊髓上行和下行轴突再生的情况。结果移植术后4周，空白组无脊髓再生轴突，化学去细胞肌肉中有大量再生的轴突，而冻融去细胞肌肉和新鲜肌肉中的再生轴突很少。锇酸染色显示化学去细胞肌肉中的有髓神经纤维较少。HRp示踪证明化学去细胞支架再生的轴突来自于其上下两端的脊髓。结论化学去细胞肌肉支架可显著促进损伤脊髓的轴突再生。
【关键词】脊髓损伤；去细胞肌肉；移植；轴突再生
aBStRaCt:objectivetoevaluateeffectsofchemicallyextractedacellularmusclegraftinpromotingaxonalregenerationafterspinalcordhemisectioninadultrats.methodstotally24maleratsunderwentspinalcordlateralhemisection.treatmentconsistedofapplicationofchemicallyextractedacellularmusclegraft(Ceam)，freezethawedacellularmusclegraft(Fam)，orfreshmusclegraft(Fm)intothelesiongap，whichwasleftemptyinlesiongroup(L).Ratsineachgroupwerekilled4weeksafterinductionoftheinjury.Holmessilverstainingmethodwasperformedtodetectaxonalregeneration.axonsinthegraftsofeachgroupwerequantified，andtheresultswereanalyzedstatistically.myelinatednervefibersinCeamwereshownbyosmicationstaining.inanothersetofsixratstreatedwithCeam，regenerationofdescendingandascendingspinalfibersoneweekaftertransplantationwasdeterminedbyanterogradeandretrogradeHRplabeling.Resultsinallthenonimplantedanimals，nodefiniteaxonaloutgrowthintothelesionwasfound.manyregeneratingaxonswerenotedtoextendintotheCeamimplantedlesion，whilethenumberofregeneratingaxonsintheFamorFmwasgreatlyreduced.However，myelinatednervefibersinCeamwererelativelyfew.HRptracingdemonstratedthattheCeamgraftscouldpromotetheregenerationofdescendingandascendingaxonsinspinalcord.ConclusionCeamcanpromoterobustregrowthofaxonsinspinalcord.
KeYwoRDS:spinalcordinjury;acellularmuscle;transplantation;axongrowth
脊髓损伤后，常因局部的抑制环境导致神经轴突不能再生。研究表明，周围神经移植可促进脊髓损伤后的轴突再生[1]，但周围神经和脊髓直径大小的不同、供体来源有限等因素限制了外周神经作为移植体的应用。周围神经的基膜成分在促进神经纤维再生中起很重要的作用。骨骼肌因具有与神经相似的基膜结构，可作为神经的良好移植替代品[2]，但新鲜骨骼肌的移植可能会产生较强的免疫排斥反应。去细胞技术可去除骨骼肌细胞，有效消除骨骼肌作为移植体的抗原性，保留基膜成分，使这种移植成为可能。
去细胞肌肉组织工程支架按制作方法大体可分为2种：冻融去细胞肌肉组织工程支架(freezethawedacellularmusclegraft，FamG)和化学去细胞肌肉组织工程支架(chemicallyextractedacellularmusclegraft，CeamG)。已有文献报道冻融去细胞组织工程支架用于脊髓损伤治疗的研究，但效果不佳[3]，而化学去细胞肌肉组织工程支架对脊髓损伤的作用目前还不清楚。本实验利用化学去细胞方法去除骨骼肌的细胞成分，把化学去细胞骨骼肌支架移植入大鼠脊髓损伤处，观察化学去细胞肌肉促进脊髓轴突再生的效果，同时与新鲜肌肉和冻融去细胞肌肉支架进行比较。
1材料与方法
1.1实验动物wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.2实验设计24只大鼠随机分成4组，制成脊髓半横断损伤模型后植入移植物或不做处理。a组，脊髓缺损处植入化学去细胞肌肉支架；B组，脊髓缺损处植入冻融去细胞肌肉支架；C组，脊髓缺损处植入从正常大鼠取出的新鲜肌肉；D组，空白组，脊髓缺损处不做处理。术后4周，银染观察脊髓轴突的再生情况，并用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维。另取6只化学去细胞肌肉治疗的模型鼠分别行HRp顺行和逆行示踪以观察再生轴突的来源。
1.3化学去细胞肌肉支架的制备参考BRown等[4]去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架。简述如下：取wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50r/min摇48h后，转入30mL/L的tritonX100溶液，摇床中37℃、50r/min摇48h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃50r/min摇48h。换成10g/L的SDS溶液，摇床37℃，50r/min摇48h。pBS洗24h。pBS中4℃保存备用。取部分支架纵切面冰冻切片，He染色观察细胞是否去除干净。
1.4冻融去细胞肌肉支架的制备取wistar大鼠椎旁肌。按下述程序处理：在30g/L的naCl溶液中浸泡10min，放入液氮至温度平衡；在蒸馏水中浸泡融化复温，再放入液氮中至温度平衡后取出，在等渗盐水中融化复温，反复3次。轻轻挤压肌条，漂洗，pBS中4℃保存备用。纵切面切片，He染色观察支架的组织结构。
1.5脊髓半横断损伤模型的制备及生物支架移植成年雄性wistar大鼠，用100g/L水合氯醛麻醉，取背后正中切口，剪开皮肤，钝性分离肌肉，暴露椎骨，行椎板切除术，暴露t10的脊髓，用虹膜剪的一侧在脊髓正中垂直插入直到透过脊髓，然后用剪刀剪下一段2mm的右半侧脊髓，于缺口处植入移植物，在移植物上方压一硅胶片以固定移植物，空白组损伤处不做任何处理，之后逐层封闭伤口。术后应用抗生素1周。
1.6Holmes镀银染色法显示脊髓移植区轴突再生情况术后4周，将模型鼠用100g/L水合氯醛麻醉，40g/L的多聚甲醛心脏灌流固定。取出含移植物部分或损伤处的脊髓，40g/L多聚甲醛4℃浸润固定，梯度蔗糖脱水，oCt冷冻包埋。恒冷箱切片机以冠状面切片，16μm厚。按Holmes镀银染色法染色显示再生的轴突。
1.7锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维取a组切片，入10g/L火棉胶液1min，取出至微干，再入800mL/L乙醇硬化1～2min，充分水洗。滴加10g/L锇酸水溶液足量覆盖切片，放在有盖暗湿盒内，置微波5档3min，取出后复温至室温，蒸馏水洗3次；梯度乙醇脱水、透明、树胶封固。
1.8HRp示踪鉴定化学去细胞肌肉支架中的再生轴突的来源为进一步验证化学去细胞支架中再生的轴突是否来源于脊髓，另采用6只模型鼠移植入化学去细胞肌肉支架后，分2组分别进行HRp顺行和逆行示踪。具体过程如下，用上述方法制备脊髓损伤模型后，移植化学去细胞支架，然后分别在移植处上方或下方0.5cm处用微量注射器注入300g/L的HRp2μL。7d后按1.6方法取材，冰冻切片，DaB显色，蒸馏水洗，梯度乙醇脱水、透明、树胶封固。
1.9图像处理与统计学分析按StoKoLS等[5]的方法，每只动物随机取2张切片，400倍镜下观察，从移植物头端、中部及尾端三个区域内各取两点，对移植物中的再生轴突计数并求和，作为这张切片的再生轴突数，两张切片的再生轴突数求平均值作为此动物的再生轴突数，每组6只动物间取平均值作为该组再生轴突数量值，实验结果以±s表示。各治疗组再生轴突数量采用SSpS11.5统计软件处理，各组均数的比较采用单因素方差分析(onewayanoVa)，有显著差异的组间分别采用t检验进行进一步验证。p
2结
果
2.1化学与冻融去细胞肌肉支架的组织结构He染色观察可见化学去细胞肌肉支架中骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道(图1)。冻融去细胞肌肉支架切片中可见骨骼肌细胞成分依然存在，但是肌细胞完整性受到破坏，细胞横纹消失，肌细胞间出现与骨骼肌长轴平行的空隙(图2)。
2.2化学去细胞肌肉支架有效促进了损伤脊髓的轴突再生移植术后4周，a组切片可见移植物中有大量宿主细胞，银染显示有大量轴突(613.17±154.96)成束长入移植物。再生的轴突规则排列相互平行并与移植物和脊髓长轴平行(图3)。B组切片可见移植物支架中有少量宿主细胞，也有与移植物长轴平行的再生轴突(44.42±5.77)长入支架，但数量明显少于a组(p
2.3化学去细胞肌肉支架中再生的有髓神经纤维鉴定锇酸染色显示a组移植物中有少量的有髓神经纤维。有髓神经纤维的数量明显少于银染结果中的再生轴突的数量(图7)。
2.4化学去细胞肌肉支架中再生轴突的来源化学去细胞肌肉支架移植后1周HRp顺行和逆行示踪结果显示移植物中有HRp阳性轴突分布，这表明损伤脊髓的头端和尾端的轴突均可长入化学去细胞肌肉支架中(图8、图9)。
3讨
论
去细胞肌肉应用在脊髓损伤的治疗有诸多优点。首先，同其他移植物类似，去细胞肌肉移植代替了损伤脊髓组织对神经元轴突再生的抑制环境，而为脊髓神经纤维的再生提供了一个有利的环境；其次，骨骼肌的细胞外基质成分如层黏连蛋白(laminin)、Ⅳ型胶原(typeⅣcollagenproteins)等，可促进神经轴突再生，冻融去细胞肌肉可自然保留这些成分，而且这些成分也可以在化学去细胞后保留在支架中发挥促进神经轴突再生的作用[6]。肌纤维的排列结构与神经纤维类似，即使化学试剂完全去除细胞后，由细胞外基质形成的相互平行的管道样结构仍然保留，它们既提供了神经轴突可生长穿过的足够空间，又为再生神经轴突提供有方向的支持和引导，这对损伤脊髓的功能恢复具有重大意义。从本实验的结果看，三组移植物中都可见再生的轴突，这反映了细胞外基质对轴突再生的作用，而再生的轴突是有组织和有方向的，表明了去细胞肌肉支架作为神经组织工程支架而具有的天然优势。
本研究中发现化学去细胞肌肉支架与新鲜肌肉和冻融去细胞肌肉支架相比，可更好促进损伤脊髓的神经轴突再生。这说明化学去细胞肌肉支架除具有上述促进神经轴突再生的机制外，可能还包括其他更重要的因素。化学去细胞支架与其他两组支架的最大区别在于其细胞成分已完全去除，仅保留细胞外基质所构成的孔道结构，这样一方面会更好的暴露了层黏连蛋白、Ⅳ型胶原等有效成分，另一方面为轴突再生提供接触引导作用而促进其再生[7]，并不产生轴突再生的阻力。此外，这种结构特点使其具有良好的通透性，利于细胞成分快速进入。本研究观察到在损伤后3d化学去细胞肌肉支架中即可见到大量宿主细胞，在移植术后4周，可见化学去细胞肌肉支架中的宿主细胞成分明显多于其他两组，而脊髓损伤后再生的细胞成分有很多是对神经轴突再生有促进作用的，比如巨噬细胞[8]，实验中我们已观察到化学去细胞支架中有巨噬细胞(本文结果未显示)。进入到化学去细胞肌肉支架中的这些细胞成分可使脊髓中损伤和再生之间的动态平衡向再生方向移动，促进脊髓轴突长入支架。这些因素的存在可能导致了a组与其他两组移植物的巨大差异。
除轴突再生外，脊髓损伤修复的另一个重要方面就是髓鞘的修复。为此，本研究用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的髓鞘生成情况。结果显示，部分再生的神经轴突有髓鞘形成，但生成髓鞘的神经纤维很少，这可能是由于内源性少突胶质细胞的前体细胞不能充分增生和分化所导致的[9]。
脊髓组织工程支架中的再生神经轴突可以来自于脊髓，也可以来自于脊髓周围神经根[10]，而移植物能促进脊髓的神经轴突再生(而不是促进神经根所代表的周围神经的再生)，相对来说是更重要的，只有这样才有可能重建脊髓神经传导通路，恢复脊髓的功能。因此本实验用HRp示踪技术验证化学去细胞肌肉支架对脊髓上行和下行神经轴突再生的促进作用。HRp示踪结果显示化学去细胞支架移植后1周，支架中可见上行和下行的HRp阳性神经轴突，这与银染的结果一致。化学去细胞肌肉移植后1个月，可见移植物头尾两端均有神经轴突长入。这表明化学去细胞肌肉支架中的再生神经轴突来源于脊髓。
综上所述，化学去细胞肌肉支架可有效促进脊髓的神经轴突再生，而且再生的神经轴突是高度规则排列和有方向的。该支架有望成为一种神经组织工程材料，用于脊髓损伤的治疗。
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