单细胞生物定义篇1
一、生物学是研究生命现象和生命活动规律的科学。它是农学、医学、林学、环境科学等科学的基础。
二、生物科学的新成就：
1、试管婴儿;2、杂交水稻;3、克隆技术;4、基因工程;中国已经成为世界生物技术强国之一。
三、环境问题：
1、森林正在减少，乱砍滥伐。森林火灾的此起彼伏，大面积毁林。
2、工厂排放的废水，海洋、河流、湖泊受到污染。
3、沙尘暴
初一上册生物知识点第一单元生物和生物圈
第一章认识生物
第一节生物的特征
一、生物的特征
1、生物的生活需要营养。生物的一生需要不断从外界获得营养物质，维持生存。
2、生物能进行呼吸。绝大多数生物需要吸入氧气，呼出二氧化碳。
3、生物能排出身体内产生的废物。
4、生物能对外界刺激作出反应。
5、生物能生长和繁殖。
6、生物还具有其他特征。除病毒以外，生物都是由细胞构成的。
二、判断下列哪些是生物，哪些不是生物?
机器人钟乳石珊瑚珊瑚虫太阳水树人动物
第二节调查我们身边的生物
一、调查的一般方法：
1、明确调查目的。2、选择材料用具。3、方法步骤：
(1)选择调查范围。(2)分组。(3)设计调查路线。(4)调查记录。(5)归类整理分析。
二、生物的分类。
1、按形态结构分：植物、动物、其他生物;2、按生活环境分：陆生生物和水生生物;3、按用途分：作物、家禽、家畜、宠物。
第二章生物圈是所有生物的家
第一节生物圈
一、生物圈的概念：生物圈是指地球上有生命活动的领域及其居住环境的整体，生物圈是地球上所有生物共同的一个家。
二、生物圈的范围：大气圈的底部、水圈的大部、岩石圈的表面。
三、生物圈为生物的生存提供了基本条件：营养物质、阳光、空气和水、适宜的温度、一定的生存空间。
第二节环境对生物的影响
一、影响生物生活的环境因素分两类：1、光、温度、水、空气等非生物因素。2、生物因素。
二、非生物因素对生物的影响：所有生物的生活都会受到非生物因素的影响。当环境中一个或几个因素发生急剧变化时，就会影响生物的生活，甚至导致生物死亡。
三、生物因素对生物的影响：生物因素是指影响某种生物生活的其他生物。自然界中的每一种生物都受到周围很多其他生物的影响。生物与生物之间的关系有：捕食关系、竞争关系、合作关系等。
四、探究实验的步骤：
1、提出问题2、作出假设3、制定计划4、实施计划5、得出结论6、表达和交流
五、探究光对鼠妇生活的影响的实验方法是：对照实验。
在研究一种条件对研究对象的影响时，所进行的除了这种条件不同以外，其他条件都相同的实验叫做对照实验。
第三节生物对环境的适应和影响
一、生物对环境的适应。
每一种生物都具有与其生活环境相适应的形态结构和生活方式。生物的适应性是普遍存在的。
二、生物对环境的影响。如：蚯蚓松土。沙地植物防风固沙等。
三、在自然环境中，各种因素(包括生物因素和非生物因素)影响着生物的生存，生物在生存和发展中不断地适应环境和影响环境。在生物与环境相互作用的漫长过程中，环境在不断改变;生物也在不断进化，适应环境。生物和环境的相互作用造就了今天欣欣向荣的生物圈。
第四节生态系统
一、定义：在一定地域内，生物与环境所形成的统一的整体叫做生态系统。
二、生态系统的组成：
生产者(主要指绿色植物)
1、生物成分：消费者(主要指动物)2、非生物成分：阳光、空气、水等。
分解者(主要指细菌和真菌等微生物)
构成生态系统的各种生物之间是相互影响，相互作用，相互依存的。
三、食物链的定义：通过一系列吃与被吃的关系，把生物与生物紧密地联系起来，这种生物之间以食物营养关系彼此联系起来的序列，称为食物链。
四、食物网的定义：一个生态系统中，多条食物链交错连接，构成了食物网。
生态系统中的物质和能量就是沿着食物链和食物网流动的，有毒物质能够沿食物链积累。
五、生态系统具有一定的自动调节能力
生态系统具有一定的自我调节能力，使得生态系统中各种生物的数量和所占比例保持相对的稳定，但是这种调节能力是有限度的，超过该限度，生态系统就会遭到破坏。
第五节生物圈是最大的生态系统
一、多种多样的生态系统：1、森林生态系统2、草原生态系统3、海洋生态系统4、淡水生态系统5、湿地生态系统6、农田生态系统7、城市生态系统8、河流生态系统等。
二、生物圈是一个统一的整体
1、生物圈中的各种生态系统，由于地域相隔，表面看来好像毫不相干，但实际上都存在着一定的联系。
2、整个生物圈在结构和功能上是一个整体，它是地球上最大的生态系统。
3、生物圈是所有生物共同的家园.保护生物圈，人人有责!
初一上册生物知识点第二单元生物和细胞
第一章观察细胞的结构
第一节练习使用显微镜
一、显微镜的构造。
二、使用显微镜的方法步骤：1、取镜和安放2、对光3、观察
三、目镜内看到的物像是倒像。目镜与物镜放大倍数的乘积就是显微镜的放大倍数。倍数越大，看到的细胞越大，看到的细胞数量越少。
第二节观察植物细胞
一、玻片标本。
1、种类：切片、涂片、装片
2、制作：需要载玻片和盖玻片
二、植物细胞的结构。
1、模式图。细胞主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核构成。细胞质内含有液泡、叶绿体
2、细胞壁的作用：起保护和支持细胞的作用。
3、西瓜甘甜可口主要是因为西瓜的细胞液中含有大量的糖分。
4、植物细胞的各种结构分别具有各自的功能，它们协调配合，共同完成细胞的生命活动。
第三节观察动物细胞
一、人和动物的细胞形态不同，基本结构是一样的。
动物细胞模式图。主要由细胞膜、细胞质、细胞核构成。
二、植物细胞和动物细胞在结构上的相同点和不同点：
相同点是：都有细胞膜、细胞质、细胞核等，是生物体的结构和功能的基本单位。
不同点是：植物细胞有细胞壁，动物细胞没有细胞壁;植物细胞有液泡，动物细胞没有液泡;植物细胞有叶绿体，动物细胞没有叶绿体。
第二章细胞的生活
第一节细胞的生活需要物质和能量
一、细胞中含有两类物质。
1、无机物：水和无机盐2、有机物：糖、脂类、蛋白质、核酸
二、细胞膜控制物质的进出。
细胞膜能够让有用的物质进入细胞，把其他物质挡在细胞外面，同时把细胞内产生的废物排到细胞外。
三、细胞质中的能量转换器。
1、叶绿体将光能转化成化学能，储存在它所制造的有机物中。
2、细胞都含有线粒体，线粒体将有机物与氧结合，经过复杂的过程，将有机物中的能量释放出来，供细胞利用。
3、叶绿体和线粒体都是细胞中的能理转换器。
第二节细胞核是遗传信息库
一、遗传信息的定义：上一代能把控制生长发育的信息传给下一代，这样的信息就叫做遗传信息。
二、遗传信息储存在细胞核中。由克隆羊的故事可以得出这个结论。
三、细胞核中储存遗传信息的物质是——Dna
1、遗传信息的载体是一种叫做Dna的有机物。Dna存在于细胞核中。
2、Dna的每个片段具有特定的遗传信息。这些片段叫基因。
四、染色体是由Dna和蛋白质两种物质组成。
1、每一种生物的细胞内，染色体的数量是一定的。如人体细胞内含有23对染色体。水稻有12对。
2、细胞的控制中心是细胞核。
3、Dna上的遗传信息是指导和控制细胞中物质和能量变化的一系列指令，也是生物体建造自己生命大厦的蓝图。
第三节细胞通过分裂产生新细胞
一、生物体由小长大，是与细胞的生长和分裂分不开的。
二、细胞的生长：新产生的细胞体积很小，通过不断地从周围环境中吸收营养物质。并且转变成组成自身的物质，体积逐渐增大。
三、细胞的分裂：一个分成两个，两个分成四个。新细胞和原细胞所含有的遗传物质是一样的。
第三章细胞怎样构成生物体
第一节动物体的结构层次
一、细胞分化形成组织。
1、在发育过程中，某些细胞各自具有了不同功能，它们在形态、结构上也逐渐发生了变化，这个过程叫做细胞分化。
2、组织的定义：细胞分化产生了不同的细胞群，每个细胞群都是由形态相似，结构、功能相同的细胞联合在一起形成的，这样的细胞群叫做组织。
3、人体的四种基本组织：
上皮组织：由上皮细胞构成，具有保护、分泌等功能。
肌肉组织：由肌细胞构成，具有收缩、舒张功能。
神经组织：由神经细胞构成，能够产生和传导兴奋。
结缔组织：支持、连接、保护、营养等功能。
二、组织进一步形成器官。
1、器官的定义：不同的组织按照一定的次序结合在一起构成器官。例如：大脑、胃、心脏、肝、肺、肾、眼、耳等。
三、器官构成系统和人体
1、系统的定义：能够共同完成一种或几种生理功能的多个器官按照一定的次序组合在一起构成系统。
2、人体的八大系统：运动系统、消化系统、呼吸系统、循环系统、泌尿系统、神经系统、内分泌系统、生殖系统。这八大系统协调配合，使人体内各种复杂的生命活动能够正常进行。
第二节植物体的结构层次
一、植物体是由受精卵经过细胞分裂、分化，形成组织、器官，最终形成植物体。
二、绿色开花植物的六大器官。
1、六大器官：根、茎、叶、花、果实、种子
三、植物的几种主要组织。
1、分生组织：位于根尖的分生区就是分生组织。
2、另外几种：保护组织、营养组织、输导组织。
第三节只有一个细胞的生物体
一、单细胞生物：身体只有一个细胞的生物。大多数生活在水里，有些生活在我们身上。
二、单细胞生物的结构和生活。
以草履虫为例：如图。草履虫的结构和生活。
三、单细胞生物与人类的关系。
有利的一面：1、多数浮游生物是鱼类的天然饵料。
2、草履虫对污水净化有一定作用。
有害的一面：1、人体内寄生虫危害人类健康。如：疟原虫、痢疾内变形虫等。
2、单细胞生物大量繁殖造成赤潮，危害渔业。
第四章没有细胞结构的微小生物——病毒
一、病毒的种类。
1、根据它们寄生的细胞不同，可以将病毒分为三大类：
一类是专门寄生在人和动物细胞里的动物病毒，如流感病毒。
一类是专门寄生在植物细胞里的植物病毒，如烟草花叶病毒。
一类是专门寄生在细菌内的细菌病毒，也叫噬菌体，如大肠杆菌噬菌体。
二、病毒的结构和生活
1、病毒的结构是由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成的。没有细胞结构。
2、病毒只能寄生在活的细胞里。离开了活细胞会变成结晶体。一有机会侵入活细胞就会重新开始生命活动。
三、病毒与人类的关系
病毒靠寄生生活，给人类、饲养动物、栽培植物带来了极大危害。
如：流行性感冒、肝炎、艾滋病、口蹄疫、鸡瘟都是由病毒引起的。
疫苗预防疾病。疫苗是经过人工处理的减毒病毒。
单元小结
1、除病毒外，生物体都是由细胞构成的。细胞是生物体结构和功能的基本单位。
2、细胞膜、细胞质和细胞核是绝大多数细胞共有的基本结构。
3、细胞的生活需要物质和能量。细胞核内含有遗传信息。细胞是物质、能量和信息的统一体。
单细胞生物定义篇2
【关键词】大蒜素；顺铂；ishikawa细胞；凋亡；端粒酶；bcl-2
effectsofallicinorallicinwithcisplatinongrowthofendometrialcarcinomainishikawacellsinvitro
jiali-gang,wanghui-lan,tianli.thepeople’shospitalofhebei,shijiazhuang050051,china
［abstract］objectivetostudytheeffectsofallicinorallicinwithcisplatinonhumanendometrialcarcinomaishikawacellline.methodshumanendometrialcarcinomaishikawacellsweretreatedwithallicinorallicinwithcisplatin.cellgrowthratewasdeterminedwithmttassay.flowcytometrywasusedtoexaminecellcycleandapoptoticrateofcells.theexpressionofbcl-2wasmeasuredbyimmunohistochemicalandtbytrapassay.resultsallicin（12.5～50mg/l）inhibitedproliferationinhumanendometrialcarcinomaishikawacellsintime-dependentanddose-dependentmanner.ishikawacellswerearrestedatg2/mphaseandresultedinapoptosisbyallicin.telomeraseactivityandtheexpressionofbcl-2wasdown-regulatedafterallicintreatmentwhenitinducedapoptosis.theeffectsofallicingroupwaslowerthanthatofallicincombinedwithcisplatin（1.0mg/l）incorrespondingconcentrationandtookamannerintime-dependentanddose-dependent.conclusionallicincouldinhibittheproliferationandenhanceapoptosisinendometrialcarcinomacelllineishikawainvitro.allicincooperatedwithcisplatinatinfluencingtheproliferationofishikawacells.theabilityofinhibitingtheproliferationandenhancingapoptosisinallicincombinedwithcisplatin（1.0mg/l）groupwasstrongerthanthatofallicingroup.allicininducedapoptosishasassociatedwithtelomerase.bcl-2wasinvolvedintheregulationoftelomeraseactivity.theabilityofitinallicincombinedwithcisplatin（1.0mg/l）groupwasstrongthanthatofallicingroup.themechamismsofallicincombinedwithcisplatinwillprovidetheoreticalbasisforendometrialcarcinomatreatmentswithlesschemotherapeuticdrug.
［keywords］allicin；cisplatin；ishikawacell；apoptosis；telomerase；bcl-2
子宫内膜癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一。对于那些不能手术或术后复发的子宫内膜癌患者，可给予化疗。然而在化疗过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常增殖细胞也有杀伤作用，因而影响化疗的疗效。而且化疗药物都有较严重的副反应，患者治疗的依从性差，生活质量明显降低。所以如何使药物对肿瘤细胞最大限度的杀伤，而对正常细胞的毒性减少到最低的化疗方案成为人们关注的焦点之一。本研究旨在通过细胞培育探讨大蒜素及与顺铂联用对子宫内膜癌ishikawa细胞生长的影响，从而为临床减少化疗药物的应用提供充分的依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验对象高分化子宫内膜腺癌细胞（ishikawa细胞系）：购自美国atcc细胞库。
1.1.2药物与试剂大蒜素为安徽安达产品有限公司惠赠。顺铂为中国齐鲁制药厂产品。鼠抗人bcl-2单克隆抗体，北京中山生物公司产品。telomerase-pcr-elisa检测试剂盒为boehringermanheim公司。
1.1.3主要仪器芬兰labsystemsdragonwellscanmn3型酶标仪。流式细胞仪（beckmancoulterepicsxlusa）。5%co2无菌恒温培养箱heraeusbb5060/bb16（上海）。
1.2方法
1.2.1细胞培育人子宫内膜癌ishikawa细胞用rpmi-1640培养液（含青霉素浓度为100iu/ml,链霉素浓度为100μg/ml,10%胎牛血清，ph值7.2），于37℃、5%co2饱和湿度培养箱内松盖培育。
1.2.2mtt检测取对数生长的ishikawa细胞，制成浓度为7×104个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔100μl，贴壁后，换培养液，实验组分为大蒜素组、顺铂组和大蒜素+顺铂组，大蒜素组（由吐温80溶解）分别加入含大蒜素为12.5、25、50mg/l的培养液（各组含0.01%吐温80）；顺铂组加入含顺铂为1.0mg/l的培养液；大蒜素+顺铂组加入含各浓度大蒜素和顺铂（1.0mg/l）的培养液，对照组为含0.01%吐温80的培养液。每一浓度均设6个平行孔。每个实验均重复3次。继续培养24、48、72h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，继续孵育4h。吸净上清液，每孔加入二甲基亚砜200μl，振荡8～10min,用酶标光度仪在波长为492nm时测定每孔的吸光度（a）值,并计算抑制率，抑制率=（对照组a值-实验组a值/对照组a值）×100%。
1.2.3细胞周期和细胞凋亡的检测将浓度为7×104个/ml接种于100ml培养瓶中。贴壁后加入上述大蒜素组和大蒜素+顺铂组培养液。对照组加入含0.01%吐温80的培养液。继续培养72h，用胰酶消化后收集细胞，用70%的冷乙醇固定，用pi（50μg/ml）1ml避光染色后,置流式细胞仪（flowcytometer,fcm）分析。
1.2.4ishikawa细胞端粒酶活性测定（1）取1×105个ishikawa细胞行裂解、端粒酶的提取，移取上清液。（2）端粒重复序列扩增反应（trap）：参照说明书。取20μg细胞提取物，反应总体积为50μl。pcr仪行产物扩增；引物延长，一个循环；端粒酶灭活，一个循环；端粒酶扩增30个循环；72℃平衡10min,4℃保存。（3）杂交及酶联免疫吸附反应（elisa），30min内于酶标仪上测定在波长450nm/690nm处的吸光度a值，根据δa=a450-a690计算。
1.2.5ishikawa细胞株bcl-2测定取浓度为7×104个/ml的ishikawa细胞，以链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（streptavidin/peroxidase,sp）法测定ishikawa细胞bcl-2抗体。在6孔板中预先放置盖玻片，将细胞悬液滴在盖玻片上，爬片后加入各浓度实验组培养液。对照组加入含0.01%吐温80的培养液。结果判定采用组织化学评分（h-score）法：每一浓度2张玻片，每片至少观察5个视野，阳性染色为细胞核内出现棕黄色颗粒，以代表染色深浅，共0～3分：0分为不着色;1分为着色浅，呈浅黄色；2分为中度着色，呈深黄色；3分为着色深，呈棕色/咖啡色。pi代表每一着色程度的细胞所占的比例，为0～100%，h-score=∑pi（i±1），满分为4分。
1.3统计学方法细胞吸光度值（a）和bcl-2表达用均数±标准差（±s）表达，多组间比较，采用方差分析。计数资料用χ2检验。所有数据均用sas软件包进行统计。p＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1大蒜素、顺铂和大蒜素+顺铂对ishikawa细胞增殖的影响本实验结果显示，当顺铂浓度为1.0mg/l时，对ishikawa细胞生长有轻度抑制作用，但与对照组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。即顺铂在该浓度时对细胞生长无影响，见表1。
而大蒜素和大蒜素+顺铂组均对细胞有明显的抑制作用（p＜0.01）,且在两组内随着时间和浓度的增加，增殖抑制率升高，增殖抑制率与时间和浓度之间具有显著正相关性（p＜0.01）。各浓度的大蒜素单独作用后的细胞抑制率低于与之相对应的大蒜素和顺铂联合作用下的增殖抑制率，两者相比，差异有统计学意义（p＜0.01），见表2。
2.2大蒜素和大蒜素+顺铂对ishikawa细胞的生长周期和凋亡率的影响经fcm检测发现，ishikawa细胞周期分布和凋亡率发生改变。大蒜素组（12.5～50mg/l）g2/m期细胞含量分别为（9±1.1）%、（28±0.6）%、（40±2.6）%，凋亡率为分别为（5.41±1.39）%、（7.38±2.08）%、（18.46±1.47）%；大蒜素（12.5～50mg/l）+顺铂（1mg/l）组g2/m期细胞含量分别为（18±1.6）%、（39±2.2）%、（56±4.6）%，凋亡率为分别为（15.17±2.63）%、（28.67±2.19）%、（43.07±1.12）%。与对照组相比，两组g2/m期细胞含量比例上升，凋亡率亦上升。大蒜素联合顺铂组较单独使用大蒜素组，其g2/m期细胞含量和凋亡率明显升高（p＜0.01），且各组内差异亦有显著统计学意义（p＜0.01），并在g1峰前出现细胞凋亡峰。
2.3ishikawa细胞端粒酶活性的表达经不同浓度的大蒜素处理24、48、72h后，细胞中端粒酶的活性呈现出随时间和浓度增加而降低的趋势，而大蒜素联合顺铂组细胞中端粒酶活性的降低较单纯使用大蒜素更明显，且与对照组比较，其差异有显著统计学意义（p＜0.01），见表3。
2.4ishikawa细胞bcl-2的表达ishikawa细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色，经不同浓度的大蒜素处理24、48、72h后，细胞中bcl-2的含量呈现出随时间和浓度增加而降低的趋势，而大蒜素联合顺铂组细胞中bcl-2的含量降低较单纯使用大蒜素更明显，两者相比差异有显著性意义（p＜0.01），且各组内差异亦有显著性意义（p＜0.01），见表4。表1作用48h对照组与顺铂组的细胞吸光度值表2不同时间大蒜素组和大蒜素+顺铂组的细胞相对抑制率表3不同时间大蒜素和大蒜素+顺铂组对细胞端粒酶活性的影响表4不同时间大蒜素及联合组对细胞bcl-2含量的影响注：各浓度组比较p<0.01；各时间组比较，p＜0.01
3讨论
大蒜是百合科葱属植物的鳞茎，主要的生物活性物质是其特有的含硫化合物，其具有降低肿瘤的危险性和抗肿瘤的生物学作用，而无明显的不良反应；而顺铂是目前应用最广泛的抗肿瘤药物，但其水溶性差、口服活性低、缓解期短、毒副作用较强，大剂量或连续用药可致严重而持久的肾毒性、听觉衰退等现象。故大蒜和顺铂联用能否既减少化疗药物的应用，减轻不良反应，又能够达到同样甚至更强的治疗效果，是本研究的主要目的。
3.1大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞增殖的影响本实验中，单纯应用大蒜素于人子宫内膜癌ishikawa细胞，所用剂量分别为12.5、25、50mg/l。药物作用24、48、72h后，经mtt检测所得抑制率与对照组比较，随着药物浓度和作用时间的增加，抑制率明显增高。表现为时间和剂量依赖关系。而顺铂作为治疗肿瘤的首选药物，其疗效是肯定的。本实验采用较低剂量的顺铂作用于人子宫内膜癌ishikawa细胞，浓度分别为1、2.5、5.0mg/l，作用72h后抑制率分别为（1.96±0.127）%、（19.02±0.189）%、（37.86±0.162）%。而当顺铂浓度为1mg/l时，其抑制率与对照组无统计学意义。表明顺铂为该浓度时对细胞无影响。本实验研究发现，若将1mg/l的顺铂分别与不同浓度的大蒜素联合应用，药物作用24、48、72h后，所得抑制率较对应的大蒜素组明显提高，表现为时间和剂量依赖关系。因而可大胆设想，在化疗药物无治疗作用的浓度时，加用大蒜素，对化疗药物有增敏作用，较单独应用大蒜素对肿瘤细胞的抑制更明显。
3.2大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响目前，有学者认为肿瘤是一类细胞周期疾病。他们认为许多癌基因、抑癌基因直接参与了细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期调控的主要成分，他们突变的结果，导致细胞周期的失控，包括细胞周期启动、运行和终止的异常，使细胞获得以增殖过多、凋亡过少为主要形式的失控性生长特征。细胞周期存在着g1/s转换和g2/m转换两个重要的控制位点。而细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。它是由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细胞死亡。miron等［1］研究发现，大蒜素能抑制hl60和u937细胞的生长并诱导其凋亡。seki等［2］报道，大蒜素诱导人类结肠癌细胞（hct-15和dld-1）的凋亡，并将细胞周期阻滞于g2/m期，且呈时间和剂量依赖关系。本研究采用fcm及细胞形态学检测手段观察了大蒜素单独和联合顺铂对子宫内膜癌ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响。透射电镜下可见到凋亡小体。fcm分析发现，大蒜素作用24、48、72h后，细胞凋亡率和g2/m期细胞比例上升，其差异有显著统计学意义（p＜0.01）；而大蒜素联合顺铂组其细胞凋亡率和g2/m期细胞比例较单纯大蒜素组上升更明显，且出现亚二倍体峰即细胞凋亡峰，呈时间和剂量依赖关系。在透射电镜下可见到凋亡小体。由此推断大蒜素单独和联合顺铂将ishikawa细胞阻滞于g2/m期，诱导细胞凋亡，从而控制了肿瘤细胞的增生。
3.3大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞端粒酶活性和bcl-2表达的影响端粒酶由rna和蛋白质组成的一种核糖白复合物（rnp）,含有端粒重复序列的模板，即以自身rna组分为模版，复制合成端粒序列。正常细胞周期中，细胞每分裂一次，端粒子链即缩短一次，经过若干分裂周期后，端粒缩短到临界长度时，细胞进入凋亡，端粒酶检测为阴性。因此端粒的缩短限制了细胞增殖能力。而癌细胞则是在某些机制作用下，启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定的维持在一定长度，从而使癌细胞得以持续增殖，并获得永生化［3］，此时端粒酶检测阳性。有研究表明，人类肿瘤中85%左右的肿瘤细胞存在端粒酶活性的表达［4］。
端粒酶rna（htr）是端粒酶的重要组分之一。mese等［5］的研究表明端粒是顺铂发挥作用的靶点。顺铂作为dna损伤剂，其同dna的连接方式主要为g-p1-g和a-p1-g的形式，而端粒酶和端粒酶htr的碱基顺序正是富含这种结构。因而顺铂抑制了htr的表达，从而对端粒酶活性进行了调节。
本实验结果显示，大蒜素能够诱导细胞凋亡（阻滞于g2/m期），其原因可能和端粒酶活性下降有关。端粒酶活性下降后，端粒缩短，细胞有丝分裂受阻，导致细胞凋亡。sharma等［6］研究发现凋亡抑制基因bcl-2能够调节端粒酶活性，当bcl-2过量表达时，端粒酶活性增强；当bcl-2表达量下降后，端粒酶活性也下降。filomeni等［7］研究发现，大蒜素能够下调bcl-2的表达。xiao等［8］研究发现,dats能诱导人类前列腺癌细胞pc-3和du145的凋亡，其机制是通过c-jun氨基末端激酶（c-jun n-terminalkinase，jnk）和erk（extracellular signal-regulatedkinase）信号通路介导的bcl-2磷酸化，bcl-2磷酸化后使得它抑制凋亡的功能丧失，受损的靶细胞发生凋亡。
本研究结果显示大蒜素及联合组在诱导ishikawa细胞凋亡的同时，端粒酶活性受抑制，bcl-2的表达下降，而且呈时间依赖性和剂量依赖性。联合组较与之相对应的各浓度大蒜素组抑制更明显。提示大蒜素在体外诱导凋亡的同时伴随bcl-2表达水平的下调及端粒酶活性的下降，表明大蒜素诱导ishikawa细胞凋亡的调控与细胞端粒酶表达之间存在密切联系，bcl-2可能是联系细胞凋亡和端粒酶调节之间的重要纽带。本实验显示大蒜素联合顺铂与单独应用大蒜素相比，大蒜素可增强顺铂对端粒酶活性的抑制作用，促进细胞的凋亡率。从而为临床上联合应用大蒜素，减少化疗药物的使用及其不良反应，而达到同样甚至更好的治疗效果提供理论依据。
【参考文献】
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4kimnw,piatyszekma,prowsek,etal.specificassociationofhumantelomeraseactivitywithimmortalcellsandcancer.science,1994,266:2011.
5meseh,ueyamay,suzukia.inhibitionoftelomeraseactivityasameasureoftumorcellkillingbycisplatininsquamouscellcarcinomacellline.chemotherapy,2001,47（2）:136-142.
6sharmah,sens,mathurbinedevaluationofexpressionoftelomerase,survivin,andanti-apoptoticbcl-2familymembersinrelationtolossofdifferentiationandapoptosisinhumanheadandneckcancers.headneck,2004,26（8）:733-740.
单细胞生物定义篇3
1.1空载纳米粒子体外溶血试验在红细胞悬浮液中加入蒸馏水，由于渗透压差异导致红细胞破裂作为阳性对照，在红细胞悬浮液中加入pBS使得红细胞不破裂作为阴性对照组，选取两种高浓度（2mg/mL、1mg/mL）的空载纳米粒子进行了溶血测试。
1.25-FU-pCL-np的体外释药研究使用分光光度计对5-FU溶液进行200~400nm的全波长扫描，确定了5-FU在水相环境下的最大吸收波长为266.4nm，调整至标准曲线模式，分别选择最大吸收波长作为光源，进行5-FU标准曲线的绘制，通过这条标准曲线，药物释放环境下，分别于0、12、24、36、48、72h测得吸光度值，并根据标准曲线计算释药量，绘制释药曲线。
1.3细胞培养Hccc-9810细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，37℃，5%Co2饱和度下培养。
1.4CCK-8法测定肿瘤细胞增殖抑制实验取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于96孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为8000个，37℃，5%Co2饱和度下培养箱孵育过夜，待细胞贴壁后，分按空白np组，单纯5-FU组，5-FU-pCL-np组（按载药率折算5-FU的量），分别按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL，每个浓度组设立5个复孔，共培养48h，后均用CCK-8法检测各孔存活细胞吸光度。细胞存活率=（处理组oD值-空白对照组oD值）/（对照组oD值–空白对照组oD值）×100%。同时计算半数有效浓度（iC50）值。
1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于6孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为2×105个，将细胞分为：空白对照组、空载纳米粒组、单纯5-FU组、5-FU-pCL-np组；根据CCK-8实验所筛选出半数有效浓度，按5-FU1.5μg/mL分别加药共培养细胞48h，用不含eDta的胰酶消化收集收集6孔板细胞，pBS清洗2遍，加入500μL的结合缓冲液悬浮细胞，加入分别5μLannexinV，5μLpropidiumiodide混匀；避光，室温下反应15min，后上机检测细胞凋亡率。
1.6统计学处理所有实验均重复3次，统计资料结果以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SnK法，p<0.05表示差异有统计学意义。使用SpSS19.0软件进行统计分析。
2结果
2.15-FU-pCL-np形态观察透射电镜照片所示，5-FU-pCL-np呈现出完好的球形形态，分布均匀无粘连情况，表明成功合成相关载药纳米材料，并且结构稳定（图1）。
2.2空载纳米粒子体外溶血试验体外溶血试验结果显示，阳性对照组出现明显溶血，阴性对照组及2个浓度的空载纳米粒子组均未出现溶血。
2.35-FU载药纳米粒子的体外药物释放体外释药实验结果显示，单纯5-FU在8h内即达峰值；而5-FU-pCL-np的释放比较平缓，在前24h达50%，在72h后达到62.9%（图3）。
2.45-FU-pCL-np对Hccc-9810细胞增殖抑制作用单纯5-FU及5-FU-pCL-np分别按按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL与Hccc-9810细胞共培养48h之后，细胞活性随药物浓度上升而下降，5-FU-pCL-np组对细胞的增殖抑制作用明显强于单纯5-FU（p<0.05）。5-FU-pCL-np组与单纯5-FU组的iC50分别为（1.32±0.12）μg/mL和（2.5±0.39）μg/mL，差异有统计学意义（p<0.05）（图4）。
2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，空白对照组和空载纳米粒子组凋亡率分别为（6.5±2.4）%、（7.2±3.1）%，两组间差异无统计学意义（p>0.05）；5-FU-pCL-np组凋亡率为（37.5±4.5）%，而单纯5-FU组细胞凋亡率分别为（26.4±3.2）%，组间比较差异有统计学意义（p<0.05）（图5）。
3讨论
胆管癌是消化道较常见的恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势，由于其恶性程度高，早期诊断困难，且因其周围解剖结构复杂，容易向周围组织侵润，手术R0切除率低（约15%~20%），预后较差，因此近年来针对胆管癌的非手术治疗逐渐成为研究的热点。
5-FU为治疗消化道恶性肿瘤的经典药物，thongprasert等报道以5-FU为基础的化疗组患者对胆管癌控制率可达50%。但其治疗剂量较大，为增强疗效而加大剂量会带来毒性作用，临床上患者表现为强烈的化疗后副反应，往往不易耐受。因此通过药物的缓释，减慢药物代谢，增加作用时间窗，提高疗效具有重要的临床意义。
纳米微球由于粒径小、比表面积大，具有特殊的体积效应和表面效应，使之具有特殊的表面性能，包括生物黏附性、电性、亲和性等，这有利于增加所载药物在吸收部位的接触时间和接触面积，加之其对药物具有明显的保护作用，故可大大提高药物的吸收和生物利用度，并可延长其在体内的循环时间，大大增加作用时间窗。聚己内酯材料是一种新型的生物可降解材料，本实验合成了5-FU-pCL-np，其载药率为15.1%，包封率为41.9%，并通过透射电镜证明了其成功合成，具有稳定的形态，同时体外药物缓释实验结果表明单纯5-FU在前8h即达峰值，而5-FU-pCL-np的释放在前24h达50%，说明具有一定突释作用，后释放趋于平稳，至72h后达到62.9%，表明该材料具有良好的药物缓释作用。体外溶血试验结果表明，高浓度的纳米材料也不会引起细胞的溶血，证明了其较好的生物安全性。CCK-8增值抑制实验表明5-FU-pCL-np对肿瘤细胞的增值抑制作用优于单纯5-FU，进一步应用流式细胞仪检测凋亡，结果提示5-FU-pCL-np明显促进了肿瘤细胞的凋亡，表明载药纳米粒子在细胞吸收后，通过缓释作用，增强了作用时间，促进肿瘤细胞的凋亡增强了药物的杀伤作用。
单细胞生物定义篇4
【关键词】培哚普利；泡沫细胞；血管内皮生长因子
［abstract］objective:tostudytheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(vegf)inducedbyoxidizedlowdensityliprotein(oxldl)andtheinhibitoryeffectsofperindoprilonthelevelsofvegfproteinandmrnaintheu937foamcells.methods:theu937cellswereincubatedwithoxldl80μg/mlfor48handamacrophagederivedfoamcellmodelwasestablished.themediumwaspretreatedwithperindopril(0.01、0.1、1μmol/l)for24h,incubatedwithoxldl80μg/mlfor48h.reversetranscriptionpolymerasechainreaction(rtpcr)andenzymelinkedimmuneosorbentassay(elisa)wereappliedtodeterminetheexpressionofvegfproteinandmrnainu937cellsandtreatedu937cells.results:vegfmrnalevelsinu937cellsafterincubationwithoxldl80μg/mlincreasedsignificantlycomparedwithcontrolcells(foamcellsvscontrolcells,2.371±0.253vs0.954±0.245,p<0.01).aftertreatedwithperindopril(0.01、0.10、1.00μmol/l),vegfproteinlevelswereconcentrationdepentlyattenuated(foamcellsvsperindopriltreatedcells,2.371±0.253vs2.168±0.270、1.533±0.248、1.022±0.189,p<0.01).vegfproteinlevelsinthemediumafterincubationwithoxldl80μg/mlincreasedsignificantlycomparedwithcontrolcells(foamcellsvscontrolcells,1804.18±177.59pg/mlvs716.19±60.82pg/ml,p<0.01).aftertreatedwithperindopril(0.01,0.10,1.00μmol/l),vegfproteinlevelswereconcentrationdepentlyattenuated(foamcellsvsperindopriltreatedcells,1804.18±177.59vs1601.46±154.68pg/ml,1377.09±110.36pg/ml,1017.89±147.18pg/ml,p<0.01).conclusion:perindoprilcansignifantlyattenuatedvegfmrnaandproteinexpressioninfoamcells.
［keywords］perindopril；foamcells；vascularendothelialgrowthfactor
动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是常见的危害严重的心血管疾病。泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，一般认为在动脉粥样硬化形成的早期,血液中的单核细胞进入内皮下间隙,在内膜下被激活后分化为巨噬细胞,后者主要通过清道夫受体无反馈性下调地吞噬大量氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，oxldl),导致细胞内脂质堆积，形成泡沫细胞。研究表明斑块内巨噬泡沫细胞分泌的血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，vegf）可促进斑块内血管新生（angiogenesis），而血管新生与斑块的生长、破裂、出血及血栓形成关系密切［1］。本研究通过氧化低密度脂蛋白诱导体外培养的人单核/巨噬细胞系u937细胞成泡沫细胞,观察vegf在泡沫细胞中的表达情况及培哚普利对其表达的影响。
1材料与方法
1.1实验材料
人单核/巨噬细胞系u937细胞（上海午立生物技术有限公司），培哚普利（天津施维雅制药有限公司），胎牛血清（杭州四季青公司），低密度脂蛋白（ldl，中国医学科学院基础研究所），trizol试剂（invitrogen公司），逆转录试剂盒（晶美公司），taq酶、10×pcr反应缓冲液、dntps、6×溴酚蓝上样缓冲液、dnamarker（takara公司），vegf酶联免疫吸附试验（elisa）检测试剂盒（r&dsystems公司）。
海南医学院学报vol.15no.1feb.20091.2ldl的氧化修饰
取0.9mg/ml的ldl1ml放入0.01mol/l的pbs100ml（ph7.4）中4℃透析24h，以除去离心过程中所加的抗氧化剂，用pbs将ldl稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，放入新鲜配制的含10μmol/lcuso4的pbs溶液中37℃孵育氧化12～24h，然后放入含1μmol/ledta的pbs（ph7.4）中4℃透析24h，以终止氧化还原反应。测定oxldl丙二醛（mda）的含量为31.97nmol/l（mda药盒），鉴定其氧化修饰程度。将制备好的oxldl以0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。将上述最终反应物用无血清无酚红1640定容至9ml，配制成80μg/ml的oxldl溶液备用。
1.3u937泡沫细胞模型的建立和分组
将人单核/巨噬细胞系u937细胞悬浮生长于含10%胎牛血清的rpmi1640培养液中，放入37℃、5%co2培养箱中培养，2d换液传代一次,至细胞密度达1.0×109个/l，将培养细胞分为u937细胞对照组、u937泡沫细胞组及3种剂量的药物干预组。u937细胞对照组：u937细胞中除加rpmi1640培养液外，不加其它任何药物；u937泡沫细胞组：rpmi1640洗2遍，换入无血清的rpmi1640培养液中，同时加入oxldl至终浓度80μg/ml培养48h，使u937细胞泡沫化。药物干预组：u937细胞用rpmi1640洗2遍后分别加入0.01、0.10、1.00μmol/l不同浓度的培哚普利液中，在温箱中37℃温育24h，再加入浓度80μg/ml的oxldl孵育48h。处理后的各细胞组及亚组分别采用逆转录聚合酶链式扩增反应（rtpcr）方法检测细胞vegfmrna表达及elisa方法检测细胞上清液vegf蛋白水平，每组重复检测6次。
1.4u937泡沫细胞油红o染色
收集细胞低速离心制成细胞悬液，涂于干净的被有1%明胶的玻片上，自然晾干。在4%的甲醛中固定12h后以新鲜配制的0.3%油红o染色20min，再以氧化苏木精衬染2min，然后以丙酮脱水1～2s后pvp封片。各步骤间均用双蒸水冲洗干净。胞浆内出现红染颗粒的为脂质染色阳性。
1.5rtpcr检测细胞vegfmrna的表达
采用逆转录试剂盒以trizol试剂一步法抽提细胞rna并定量，各样本均加入总rna2μg，逆转录合成第一链cdna。cdna扩增聚合酶链反应，引物：vegf上游5′ggacatcttccaggagta3′，下游5′tgcaacgcgagtctgtgt3′，扩增产物356bp；内参βactin上游5′atcgtgcgtgacattaagg3′，下游5′acaggactccatgcccagg3′，扩增产物195bp。逆转录酶链反应条件：94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环。反应完成后用含有5mg/l溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶对rtpcr反应产物进行电泳，用数字成像系统进行分析和拍照。
1.6elisa检测细胞上清液vegf蛋白水平
采用双抗体夹心法，按照试剂盒操作步骤，以rpmi1640培养液为空白对照，将不同浓度的vegf标准品（2000、1000、500、250、125、62.5、31.5pg/ml），在酶标仪上波长为450nm波段测定光密度值，以vegf标准品浓度为横坐标、光密度值为纵坐标进行直线相关回归，根据待测标本的光密度值在直线上查出相应的vegf蛋白水平。
1.7统计学处理
所有计量资料均用均数±标准差（±s）表示，采用spss11.0统计软件，数据处理用单因素方差分析，检验水准a=0.05。
2结果
2.1u937泡沫细胞模型的建立
u937细胞长至1×106/ml后用80μg/ml的oxldl刺激48h，油红o染色后光镜下可见细胞胞浆内存在大量的脂滴，符合泡沫细胞的形态特征，u937泡沫细胞模型建立。
2.2u937细胞vegfmrna表达的变化
oxldl刺激u937细胞48h成为u937泡沫细胞后，vegfmrna的表达较u937细胞对照组明显增加（p<0.01）。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后，其vegfmrna表达水平呈浓度依赖性下降，较u937泡沫细胞组差异有统计学意义（p<0.05～0.01）,不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义（p<0.01）（表1）。不同浓度培哚普利处理u937细胞后rtpcr检测vegfmrna的结果见图1。
2.3u937细胞上清液vegf蛋白水平的变化
与u937细胞对照组相比，u937泡沫细胞组vegf蛋白表达水平增加了1.52倍，差异有统计学意义（p<0.01）。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后，vegf蛋白水平呈浓度依赖性下降，较u937泡沫细胞组差异有统计学意义（p<0.05～0.01）,不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义（p<0.01）（表2）。表1各组u937细胞vegfmrna表达的变化注：与u937细胞对照组比较，*p<0.01；与u937泡沫细胞组比较，＃p<0.05，p<0.01；与0.01μmol/l培哚普利组比较，■p<0.01；与0.10μmol/l培哚普利组比较，p<0.01。表2各组u937细胞上清液vegf蛋白水平的变化注：与u937细胞对照组比较，*p<0.01；与u937泡沫细胞组比较，＃p<0.05，p<0.01；与0.01μmol/l培哚普利组比较，■p<0.01；与0.10μmol/l培哚普利组比较，p<0.01。
3讨论
研究表明，oxldl是动脉粥样硬化的独立危险因子，在动脉粥样硬化过程中起着关键作用［2］。oxldl作为氧化信号使巨噬细胞中接受氧化物成分的转录因子激活，刺激包括vegf在内的一系列细胞因子及生长因子表达，诱导单核细胞粘附于动脉内皮并分化为巨噬细胞，巨噬细胞清道夫受体大量摄取oxldl而不受胞内胆固醇含量的影响，导致体内胆固醇蓄积，最终促进单核/巨噬细胞转变为泡沫细胞，无疑促进了动脉粥样硬化的发生［3，4］。泡沫细胞的形成贯穿了动脉粥样硬化发生、发展的整个过程，泡沫细胞分泌的炎性细胞因子和生长因子对于斑块的稳定性有重要的作用。
vegf与斑块内的血管新生有密切关联。vegf是ferrara等［5］从脑垂体滤泡星状细胞培养液中提取的一种能与肝素结合的二聚体糖蛋白，这种蛋白对血管内皮细胞有特异性分裂增殖的作用。vegf作为一种特异的内皮细胞丝裂原分裂蛋白，可引起血管系统和一系列病理过程，包括肿瘤生长、伤口愈合和糖尿病视网膜病变的发展［6］。vegf在正常血管上无表达，但主要存在于人动脉粥样硬化损害部位，在早期动脉粥样硬化损害中，vegf多存在于内皮下巨噬细胞丰富的部位。在粥样斑块中，检测到vegf存在于由脂质丰富的巨噬细胞组成的粥样损害中央和主要由平滑肌细胞组成的斑块基底部［1］。celletti等［7］将新西兰大白兔高脂喂养3个月，单独肌肉内注射vegf，7～21d后取兔胸主动脉进行形态学和免疫组化分析，发现注射vegf组兔的平均斑块面积、斑块周长、最大斑块厚度、内皮密度（内皮占斑块厚度的比率）以及巨噬细胞密度均较注射白蛋白组（对照组）有非常显著性增加，从而提示vegf能增加高脂喂养的兔胸主动脉动脉粥样硬化斑块形成的程度和数量。inoue等［8］发现oxldl可使thp1、u937等单核巨噬细胞及人冠状动脉内皮细胞的vegfmrna及蛋白表达增加，并指出该作用是通过激活细胞过氧化物增殖体激活受体γ信号来实现的。此外，血管紧张素ⅱ（angiotensinⅱ，angⅱ）、高葡萄糖、高同型半胱氨酸均可诱导血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞表达vegf［911］，说明vegf参与了动脉粥样硬化有关的危险因素，如高血脂、高血压、高血糖、高同型半胱氨酸血症导致动脉粥样硬化的过程。
u937细胞是一种人单核/巨噬细胞株，常用于动脉粥样硬化发病机制的研究，用oxldl刺激u937细胞可制作可靠、稳定的单核/巨噬细胞源性泡沫细胞模型［12］。该泡沫细胞模型避免了个体差异,也避免了从人体取材原代细胞培养的麻烦，能为研究泡沫细胞提供大量稳定可靠的细胞材料。u937细胞无经典的a类清道夫受体，但存在b类清道夫受体cd36。本实验用80μg/mloxldl刺激u937细胞48h，通过油红o染色发现泡沫细胞形成。用trizol一步法抽提细胞的总rna并进行rtpcr发现经oxldl刺激后形成的u937泡沫细胞vegfmrna表达较对照细胞组明显增加，差异有统计学意义。夹心抗体酶联免疫定量法检测vegf蛋白表达量发现，与u937细胞对照组相比，u937泡沫细胞组vegf蛋白水平升高了1.52倍，差异有统计学意义。本实验的oxldl对单核/巨噬细胞vegfmrna及蛋白表达的影响与以往的报道相符。以往的报道多是单纯的从单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞角度来考虑的，而本研究则是从泡沫细胞角度来观察vegf的表达情况。泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要特征，泡沫细胞的vegf表达可能更具有病理意义。本实验提示了oxldl诱导的泡沫细胞vegf表达可能在动脉粥样硬化发生、发展过程中起一定作用。
angⅱ能促使动脉粥样硬化斑块形成，血管紧张素转换酶抑制剂（acei）可抑制angⅱ生成从而具有抗动脉粥样硬化的作用。acei还具有稳定斑块作用，动物实验表明它不仅能降低斑块体积，还能减少巨噬细胞聚集发生率和增加细胞外基质，但这种有益的效应不能完全用降血压作用来解释。hope试验结果表明，acei雷米普利能显著减少高危冠心病病人的心血管不良事件，提示雷米普利具有抗炎、稳定斑块的作用。europa也揭示了培哚普利防治冠心病的作用，能显著减少主要终点事件（心血管死亡、急性心肌梗死和血运重建）。europa亚组研究（pertinent）进一步阐明了培哚普利的可能机制［13］：（1）减少angⅱ和肿瘤坏死因子a（tnfα）水平；（2）显著增加缓激肽水平；（3）上调内皮型一氧化氮合酶（enos）的活性并降低内皮细胞凋亡率；（4）降低血管性血友病因子（vwf）水平。本实验结果发现oxldl刺激的u937泡沫细胞vegfmrna及蛋白水平表达显著增加。在加入acei培哚普利后，随着浓度（0.01、0.10、1.00μmol/l）的增加，u937泡沫细胞表达vegfmrna及蛋白逐渐降低，差异有统计学意义。本实验证实了培哚普利体外干预泡沫细胞可从转录、翻译角度呈浓度依赖性降低vegf表达水平，培哚普利有可能通过降低泡沫细胞vegf的表达来发挥治疗动脉粥样硬化、稳定斑块的作用。murakami等［14］报道急性心肌梗死发作36h内给予培哚普利或坎地沙坦，并不能显著降低外周血vegf水平。本研究与该报道不同，原因可能为急性心肌梗死具有严重的缺血缺氧，而缺氧是vegf表达的强刺激，vegf表达对缺血心肌侧枝循环的建立有帮助，是一种代偿性保护机制，可能acei降低泡沫细胞vegf的程度不足以抵消外周血vegf升高的程度。
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12李全忠，杨永宗，易光辉,等.u937泡沫细胞模型的建立［j］.中国动脉硬化杂志,1998,2：152154.
单细胞生物定义篇5
【关键词】鳞状细胞癌;端粒酶逆转录酶(hteRt);tca8113细胞;细胞凋亡
theeffectofantisenseoligodeoxynucleotidesagainsthteRtonapoptosisofhumantonguesquamouscellcarcinoma
LiUZhihui1CHenShunyue1wanGHuiming2
【abstract】objective:toinvestigatetheeffectofantisenseoligodeoxynucleotidesagainsthteRtonapoptosisofhumantonguesquamouscellcarcinoma.method:tca8113cellsinculturemediumweretreatedwithdifferentconcentrationsofantisenseoligedeoxynucleotideofhteRt,weredetectdbymttassay,FCmanalysis,Dnaladdertest,Rt-pCR.SenseoligedeoxynucleotideofhteRt,blankcarrier,andblankcuturemediumrespectivelywereservedascontrolgroups.Results:thepvaluesoftheratioofcellapoptosisandtheSphaseofcellcyclewerelessthan0.05betweentheexperimentalgroupandcontrolgroups,bothofthepvalueswereconsideredsignificant(p
【Keywords】squamouscellcarcinoma,humantelomerasereversetranscriptasesubunit(hteRt),tca8113cellline,cellapoptosis
【中图分类号】R44.6【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0001-03
端粒酶是肿瘤发生、发展关键步骤。其中,端粒酶逆转录酶基因又称端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hteRt)基因作为端粒酶三大组分之一,是决定端粒酶活性的关键性分子,它在端粒酶活性失控、肿瘤形成中起重要作用。国内外采用反义hteRt或(和)反义端粒酶Rna(telomeraseRna,htR)技术逆转了淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、腺样囊性癌细胞恶性表型[1~5]。但目前关于反义hteRt抑制舌癌细胞增殖、诱导凋亡报道较少。本实验采用脂质体作介导,用端粒酶逆转录酶基因作为分子靶点,将反义hteRt基因导入口腔鳞癌tca8113细胞,观察其对细胞生物学行为的影响,探讨hteRt作为靶点治疗舌癌的可行性。
1材料与方法
实验材料。
1.1实验细胞株。人舌鳞状细胞癌细胞系tca8113细胞,由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔生物研究室建系并提供。
1.2实验主要试剂及药品。Rpmi1640培养基(美国GibcoBRL公司),特级小牛血清(杭州四季青生物工程公司)。小量凋亡Dna抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。脂质体(oligofectamine(tm)Reagent,invitrogen公司,美国)。annexinVFitC检测试剂盒(Coulter公司,美国)。碘化丙锭(Sigma公司产品)。细胞总Rna抽提试剂tRizol(invitrogen公司,美国)。
2方法
2.1细胞培养。tca8113细胞生长于Rpmi1640培养液中,内含体积分数为10%小牛血清,于37℃、体积分数为5%Co2的饱和湿度孵箱中培养。3天换液传代一次,取对数生长期细胞做后续实验。
2.2细胞增殖检测―mtt试验。取对数生长期的tca8113细胞,分别按寡核苷酸浓度0.5,1.0,2.0μmol/L加入每孔,均设3复孔。另设一个调零孔(只含培养液,不含细胞和药物)。置培养箱37℃培养后第24、48、72h,每孔加入mtt溶液(5mg/mL)20μL。37℃培养4h后,离心倾去上清,每孔加入DmSo200μL。于30min内在酶标仪上读取吸光度值oD570nm,每孔测3次,计算细胞增殖抑制率。
2.3细胞Dnaladder(凋亡梯子)检测。细胞小量凋亡Dna的抽提纯化,严格按照试剂盒说明进行。Dna产物琼脂糖凝胶电泳分析:取10μLDna,50mV,在2.0%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)上电泳1h,凝胶成像分析仪摄影,KoDaK图象分析系统摄片。
2.4反义寡核苷酸的设计与转染。选择人hteRtmRna3584~3565bp,作为靶位点合成与之互补的反义寡核苷酸(aSoDn),同时设序列与靶位相同的正义寡核苷酸(SoDn)为对照。寡核苷酸序列如下:aSoDn:5'aCtCaCtCaGGCCtCaGaCt3'分子量为6020
SoDn:5'aGtCtGaGGCCtGaGtGaGt3'分子量为6206经计算机检索证实与其他已知的人类基因无同源性。由上海生物工程公司合成纯化,寡核苷酸的碱基均进行全硫代修饰。
寡核苷酸的转染:参照说明书进行。每组每个浓度设3个平衡复孔,并设空白对照(不加任何寡核苷酸)和转染相应浓度oDn时所需的空载体对照,分别命名为空白培养基组、空载体0.5μm、1.0μm和2.0μm组。
2.5逆转录聚合酶链反应(Rt-pCR)检测tca8113细胞中CyclinD1和Bcl-2mRna的表达采用Rt-pCR法。
用tRiZoL溶液提取细胞总Rna。
温度循环按表中进行。
经2.0%的琼脂糖,将pCR产物10μL,在电压为100V的条件下电泳30min。紫外线下观察并经KodakDigital系统成像。将目的基因条带与β-actin条带的密度扫描值比值作为目的基因的表达相对水平。
2.6细胞凋亡检测。调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/mL,700rpm,4℃离心5min,按annexinV-FitC检测试剂盒说明分别加入BindingBuffer、annexinV和5μLpi,避光室温反应15min,在1h内上机检测。
2.7细胞周期检测。待测样本制成单细胞悬液,用预冷的70%冷乙醇固定,过夜,加入Rnasea(终浓度为20μg/mL),37℃孵育30min,重悬于1mLpi染液(终浓度为50μg/mL),4℃避光1h,上机检测,资料用cellQuest细胞周期分析软件处理。
3统计学处理
所得实验数据以均数±标准差表示,所有数据应用SpSS11.0forwindows统计软件进行处理,组间差异比较采用anoVa单因素方差分析,以p
4结果
4.1反义寡核苷酸对tca8113细胞增殖的影响(oD570nm,±SD)反义寡核苷酸组tca8113细胞增殖减慢,0.5μm组细胞尚能缓慢增殖,2.0μm组细胞基本无明显增殖,在加反义寡核苷酸72h后,细胞数量低于接种24h时数量。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组tca8113细胞随培养时间延长呈指数增长,不受影响。见图1。
图1各组tca8113细胞增殖曲线
4.2反义寡核苷酸对tca8113细胞周期和凋亡的影响。
4.2细胞形态学变化。在倒置显微镜下观察,反义寡核苷酸组细胞随作用时间和作用浓度的增加,贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落;细胞间隙增大,部分细胞核深染,胞膜皱缩,细胞形态呈圆形或椭圆形,作用72h效应较明显。2.0μm反义寡核苷酸组可见细胞凋亡特征性的细胞膜完整但周围出现颗粒的发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间培养72h后连接紧密,分裂活跃,细胞为多边形,触角外展,细胞巢团状分布,无细胞发泡现象,未见凋亡小体。
4.3Dnaladder琼脂糖凝胶电泳分析。24h时,各组细胞的Dnaladder(“梯状”条带)不明显。反义寡核苷酸组2.0μm在48h时即检测到清晰的细胞凋亡特征性的Dnaladder,72h时,0.5μm、1.0μm和2.0μm反义寡核苷酸均可检测到该梯状条带。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间在三个时间点均未检测到Dnaladder,只在加样孔附近出现明亮的大分子单一条带。
4.4流式细胞仪法检测细胞凋亡率变化。0.5μm~2.0μm反义寡核苷酸转染tca8113细胞培养72h后,与空白对照组比较,annexin-V/碘化丙锭双染色法检测到细胞早期凋亡率增加,反义寡核苷酸诱导的细胞凋亡率随反义寡核苷酸浓度和培养时间的增加而增高。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组虽随时间增加出现凋亡率略增高,但与空白培养基组无差异。
anoVa分析,F=75.386,*与空白组比较,p0.05。
4.5流式细胞仪法检测tca8113细胞周期。如表3所示,反义寡核苷酸组细胞G0/G1期细胞比率上升,S期细胞比例下降,说明细胞在反义寡核苷酸作用下,细胞周期阻滞在G0/G1期,与正义寡核苷酸组、空载体组和空白培养基组比较有差异(p
anoVa分析,F=3.357,*与空白组比较,p0.05。
5讨论
近年来,端粒酶与恶性肿瘤的高度相关性引起人们的极大兴趣,成为肿瘤领域的研究热点之一。新近较多研究表明抗hteRt能够抑制肝癌、肺癌、白血病和前列腺癌等恶性肿瘤的生长[6~9]。然而,有关抗端粒酶途径治疗口腔鳞癌目前鲜有报道。为进一步探讨抗端粒酶逆转录酶途径治疗舌癌的可行性,并了解其作用的可能机制,我们在本研究中观察了靶向hteRt的反义寡核苷酸对tca8113细胞增殖和和凋亡的影响,对这一作用相关的分子事件作了一些探索。
反义技术作为基因“封条”,能够特异性封闭或抑制其靶基因的表达。但是,不同的研究针对的靶点不同,有以模板区为靶点,有以启动子区为靶点,其效用也存在分歧。本研究针对hteRt基因设计合成含20个碱基的硫代寡核苷酸,证实反义寡核苷酸在体外对tca8113细胞的增殖有明显的抑制作用,此抑制作用呈现一定的浓度和作用时间相关性。本研究中反义寡核苷酸0.5μm时tca8113增殖出现一定的抑制,但并没有出现细胞大量凋亡的现象,而2.0μm反义寡核苷酸作用48h开始,细胞出现负增长。本研究中也发现一个现象,细胞若继续培养到96h再经过换液培养后,细胞数量并没有出现全面死亡,存留的少量细胞会出现重新分裂、繁殖。这可能是因为:1.反义寡核苷酸对tca8113细胞作用有一个有效作用浓度和时间[10]。反义寡核苷酸有瞬间释放的效应,96h后有少量细胞逃脱凋亡的细胞重新分裂繁殖,引发残余肿瘤复发的危机。这现象提示反义hteRt应该重复或多次给药。另外,采取构建质粒的方法,也能持续产生反义序列,但这种方法用于体内可能会造成生物污染,如病毒的转入等[11]。2.端粒酶抑制剂作为一种快速有效的抗肿瘤方法并不能单独使用。多数研究认为端粒酶hteRt是肿瘤发生发展的必需前提,但不是唯一条件。与顺铂或反义c-myc基因等联合治疗肿瘤将更彻底杀灭肿瘤细胞。在肿瘤研究领域,可以将反义技术和常规治疗方法相结合,提升治疗肿瘤细胞的综合能力[12]。
本研究的反义寡核苷酸针对hteRt基因3'端非编码区,这一区域为mRna的不稳定部位,对tca8113细胞的hteRt和增殖有较强的抑制作用。反义寡核苷酸抑瘤作用存在序列相关性。Kraemer设计了针对5个不同位点的23条反义hteRt寡核苷酸作用于膀胱癌eJ28细胞,发现5条有抑制作用,对hteRt的最高抑制率达88%,细胞增殖抑制率为67%[13]。本研究也发现,该反义片段抑制tca8113细胞增殖作用有序列特异性。正义序列与寡核苷酸的GC含量一致,但正义寡核苷酸对tca8113细胞增殖无明显影响。而部分研究认为正义序列能较空白对照促进细胞增殖,引起hteRt的过表达,这可能与反义寡核苷酸序列的靶位设计有关。
从形态学观察,贴壁的细胞出现增殖能力减弱的改变,包括变圆、脱落,连接松弛,细胞体积变小和细胞膜完整的发泡现象等。正义组、空载体组和空白培养基组却没有类似改变。流式细胞仪结果证实反义组细胞增殖受抑,发生凋亡的现象。反义寡核苷酸组tca8113细胞S期细胞比例下降,G0/G1期细胞比例较对照组增加。虽然反义寡核苷酸组没有检测到明显的亚G1峰,但早期凋亡率出现上升。
综上所述,本研究表明,诱导细胞凋亡是靶向hteRt反义寡核苷酸引起tca8113细胞增殖抑制的途径之一。随着反义技术迅速发展,人类基因组计划的完成,将可能出现新的更富杀伤力的基因,这会给反义Rna治疗舌癌提供更大的用武之地。
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单细胞生物定义篇6
关键词：染色体组；单倍体；多倍体
高中生物教学中，“染色体组、单倍体、多倍体”的理解与判断一直是一个教学难点。很多时候，学生感觉弄懂了，但遇到实际问题时又模糊不清。为此，本文提出以下认识供参考。
一、对概念的理解
1.染色体组
教材中染色体组的概念，是利用果绳体细胞中染色体组成图示说明的“一般地说，像生殖细胞中的一组大小、形状各不相同的染色体就叫―个染色体组”。这里“一般”是指像果绳这样含有两个染色体组的生物，生物界中几乎全部动物和一半左右的高等植物体细胞中都是像果绳一样含有两个染色体组，因此，其正常生殖细胞中的染色体就是一个染色体组。但并不是每种生物的生殖细胞中都只含有一个染色体组，如普通小麦是六倍体，其生殖细胞中就有三个染色体组而不是一个染色体组。所以上述概念中的生殖细胞特指二倍体生物的正常的生殖细胞，概念中的“一组大小、形状各不相同的染色体”是最重要的，由此可知，染色体组中不含同源染色体。这里为了帮助学生正确理解染色体组的概念，我们可打一个比喻，某印刷厂要把某部小说印成1000本，因此他们要把每页印1000张，然后每页依次取一张组合在一起就构成了一部书。一本书中没有重复的页码就好比一个染色体组中没有重复相同的染色体一样。
2.单倍体
常被误认为体细胞中含有一个染色体组的个体就是单倍体，这是没有弄清单倍体的来源。单倍体的产生有两种原因：(1)自然条件下由未受精的卵细胞直接发育而来；(2)在人为条件下采用花药离体培养得到的。由此可见，单倍体是由本物种正常个体的配子发育而来的，它的确不是以体细胞中含有的染色体组的数目为依据，而是以是否由配子直接发育而来为依据，不同生物的单倍体的体细胞中，染色体组的数目可以是不同的。故教材对单倍体的定义为单倍体是指体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。也就是说，配子中有几组染色体，单倍体的体细胞中就是几组。比如，普通小麦为六倍体，体细胞中有六个染色体组，而以它的花粉培养出的单倍体植株的细胞中就含有三个染色体组，只有二倍体生物的单倍体才是一个染色体组。所以，只要是由配子发育成的个体，无论其体细胞中含有几组染色体均叫单倍体。
3.多倍体
教材中多倍体的定义为凡体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体称为多倍体。多倍体的产生原因有：(1)自然界中的多倍体主要是受外界环境条件剧烈变化的影响而形成的。当植物细胞进行有丝分裂时，染色体复制了，但由于自然条件剧烈变化的影响，有丝分裂受阻，于是细胞核内的染色体数目加倍。这种染色体数目加倍的细胞继续进行正常的有丝分裂，并通过减数分裂，形成数目加倍的生殖细胞，由这些生殖细胞结合成的合子进一步发育成的植株就是多倍体。(2)在人为条件下，用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，抑制纺锤丝的形成，从而形成多倍体。
二、染色体组、单倍体、多倍体的判定
1.染色体组数的判别
由于一个染色体组内各染色体的形态、大小各不相同，细胞内染色体组数目可按下列两种方法加以判别：
(1)细胞内同一形态的染色体有几条就可以判认为含有几个染色体组。如图1中细胞内同一形态的染色体有3条，此细胞中就有3个染色体组。
(2)在细胞或生物体的基因型中，同一种基因(不分显隐性)出现几次，则细胞中就有几个染色体组。如图2中细胞的基因型aaaaBBbb，基因a和a(或B和b)共有4个，则该细胞中共有4个染色体组。
2.生物体倍数的判别
由于多倍体的生殖细胞内含有不止一个染色体组，由这样的生殖细胞直接发育成的个体是单倍体，而不能根据细胞内染色体组的数目叫做几倍体。由此可见，生物几倍体的判别不能只看细胞内含有多少个染色体组，还要考虑到生物个体发育的直接来源。
(1)如果生物体是由受精卵或合子发育而成，生物细胞内含有几个染色体组就叫几倍体。
(2)如果生物体是由生殖细胞卵细胞或花粉粒直接发育而成的，无论细胞内含有几个染色体组，都只能叫单倍体。简而言之。判断生物体倍数应先看生物体的发育来源，再看细胞内的染色体组的数目。
单细胞生物定义篇7
【关键词】血管内皮生长因子受体2
ConstructionandidentificationofsiRnaexpressionvectortargetingKDR
【abstract】aim:toconstructpSilencertm3.1H1smallinferferingRna（siRna）expressionvectortargetinghumanKDRgeneandtoobserveitssilencingeffectinthepC3prostatecancercellline.metHoDS:thedesignedoligostargetingKDRwereclonedintothepSilencertm3.1H1neovector，whichwaslineatedafterBamHⅠandHindⅢdigestion.therecombimantvectorswereconfirmedbyenzymedigestionanalysisandDnasequencing.therecombimantvectorsofpSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3weretransfectedbyliposomemediatedtransfectionintothepC3prostatecancercelllinewithhighmetastasispotential.at72haftertransfection，theexpressionofKDRatthelevelsofmRnaandproteinwasdetectedbyRtpCRandwesternblotting.ReSULtS:thepSilencertm3.1H1siRnaexpressionvectorswereconstructedandconfirmedaftertheenzymedigestionanalysisandtheDnasequencing.thesiRnaexpressionvectorsofpSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3，weresuccessfullyconstructed.pSilencer3.1KDR3wasmosteffectiveinthe3whichdownregulated55%mRnaandproteinofKDRat72haftertransfection.ConCLUSion:pSilencertm3.1H1siRnaexpressionvectorstargetingKDRweresuccessfullyconstructed.theexpressionofKDRgenewasinhibitedeffectivelyinpC3cellstransfactedbypSilencer3.1KDR3，whichlaidabasisforitsapplicationinthetreatmentofprostatecancer.
【Keywords】vascularendothelialgrowthfactorreceptor2;Rna，smallinterfering;pC3cellline
【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VeGFR2)，又称激酶功能区受体（KDR）的pSilencertm3.1siRna(smallinterferingRna)表达载体，并在前列腺癌细胞pC3中观察其干扰效果.方法：设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经BamHⅠ，HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencertm3.1H1neo中，对重组质粒进行酶切分析和Dna系列测定.以脂质体法将pSilencertm3.1H1neo空载体和3个(pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3)重组质粒分别导人pC3前列腺癌细胞系.72h后用RtpCR和westernblotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDRmRna及蛋白水平的表达情况.结果：经酶切鉴定及Dna测序，重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDRsiRna的前列腺癌细胞，72h后，而以pSilencer3.1KDR3的抑制KDRmRna及蛋白表达效果最为有效，其抑制率约为55%.结论：成功构建了针对KDR的Rna干扰表达载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3，pSilencer3.1KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.
【关键词】血管内皮生长因子受体2；Rna，小分子干扰；pC3细胞系
0引言
血管内皮生长因子受体Ⅱ(vascularendothelialgrowthfactorreceptorⅡ，VeGFR2)，又称激酶功能区受体（kinasedomainreceptor，KDR)，在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VeGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有VeGF和KDR表达，存在VeGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］.Rna干扰(Rnainterference，Rnai)是指双链Rna介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程，它作为新兴的基因阻断技术，目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究.我们通过构建KDR基因特异性smallinterferingRna(siRna)表达载体，检测其对前列腺癌细胞系pC3中KDR基因的沉默作用，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料pSilencertm3.1H1neo质粒购自美国ambion公司；KDR特异性Dna片断由北京赛百胜公司合成；BamHⅠ，HindⅢ限制性内切酶，t4Dna连接酶，Dna酶Ⅰ，taq酶购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取和反转录试剂盒购自美国promega公司；Rpmi1640培养基、Rna提取、Lipofectamine2000转染试剂购自美国invitrogen公司；pC3细胞株，DH5a菌种为本室保存；小鼠抗人KDR单克隆抗体购自R&D公司；免疫印记所用二抗（羊抗鼠）、DaB显色液均购自武汉博士德公司；GapDH内参及其抗GapDH单抗均购自上海康成生物有限公司；mini2Dcell型电转印仪为BioRaD公司生产；DU800核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品；FR200图像分析系统为上海复日科技公司产品；peGFpn2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.
1.2方法
1.2.1siRna靶序列的设计根据shRna设计原则［3］及KDR(基因号aF063658)cDna序列，使用美国ambion公司在线设计软件设计针对KDR基因编码区（a：395414；B：29692988；C：39063925）特异性插入片断序列共三对六条，分别命名为（pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2，pSilencer3.1KDR3）.pSilencer3.1KDR1：正义链为5′GatCCGCatGGaGtCGtGtaCattattCaaGaGataatGtaCaCGaCtCCatGttttttGGaaa3′；反义链为5′aGCttttCCaaaaaaCatGGaGtCGtGtaCattatCtCttGaataatGtaCaCGaCtCCatGCG3′；pSilencer3.1KDR2：正义链为5′GatCCGCtCCtGaaGatCtGtatattCaaGaGatataCaGatCttCaGGaGCttttttGGaaa3′；反义链为5′aGCttttCCaaaaaaGCtCCtGaaGatCtGtatatCtCttGaatataCaGatCttCaGGaGCG3′；pSilencer3.1KDR3：正义链为5′GatCCGCGGCtaCCaGtCCGGatattCaaGaGatatCCGGaCtGGtaGCCGCttttttGGaaa3′；反义链为5′aGCttttCCaaaaaaGCGGCtaCCaGtCCGGatatCtCttGaatatCCGGaCtGGtaGCCGCG3′.黑体部分为KDR基因特异性序列，序列经同源性分析后，提交公司合成.
1.2.2KDRsiRna表达载体的构建合成编码发夹结构siRna的正义链和反义链，分别取5μL正反义寡核苷酸(终浓度均为25mol/L)，10μL5×退火缓冲液(500mmol/LnaCl，50mmol/Ltris，pH7.6)，加入30μL去离子水于95℃水浴中5min，然后自然冷却至室温.将退火后的双链siRna模板与载体于16℃连接过夜，以连接产物转化e.coliDH5a感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体.扩增白色的抗性菌落并提取质粒，以BamHⅠ，HindⅢ双酶切鉴定重组质粒.收集酶切鉴定正确的重组质粒，提交大连宝生物公司进行Dna序列测定.
1.2.3转染用质粒Dna的制备、纯化及定量以去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取pSilencertm3.1H1neo空载体和KDRsiRna重组质粒.经分光光度计和电泳检测，a260nm/a280nm>1.8，且无任何降解的Dna用于转染.
1.2.4KDRsiRna质粒的细胞转染用去内毒素质粒提取试剂盒提取测序正确的各重组质粒和peGFpn2质粒.将pC3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，Rpmi1640培养液（含100mL/L小牛血清，100万U/L青霉素，100万U/L链霉素），37℃，5mL/LCo2培养至80%左右，更换无抗生素、无血清的Rpmi1640培养液继续培养6h，分别用各重组质粒转染pC3细胞，使用美国ambion公司提供的含有与任何已知序列不同源的shRna序列的质粒为阴性对照和未转染照.每孔质粒用量为2μg，脂质体用量为5μL.以peGFpn2质粒同步转染检测转染效率.转染后6h更换为含200mL/L小牛血清无抗生素Rpmi1640培养液.瞬时转染后72h收获细胞检测KDR的表达水平.
1.2.5KDRsiRna转染细胞KDRmRna表达的RtpCR检测转染后72h，提取总Rna并定量，用Dna酶Ⅰ处理总Rna以去除Dna污染，各实验组取同等量的Rna反转录后进行pCR.pSilencer3.1KDR1位点pCR引物正义链：5′GCCCaataatCaGaGtGGCaGtG3′，反义链：5′GaGaCGGaCtCaGaaCCaCatCa3′，产物长度506bp；pSilencer3.1KDR2位点pCR引物正义链：5′GCaCGattCCGtCaaGGG3′，反义链：5′ttCaaaGGGaGGCGaGCa3′，产物长度383bp；pSilencer3.1KDR3位点pCR引物正义链：5′aCGGaCaGtGGtatGGtt3′，反义链：5′CGaGtCaGGCtGGaGaat3′，产物长度279bp.内参照βactin，pCR引物正义链：5′GCtCGtCGtCGaCaaCGGCtC3′，反义链：5′CaaaCatGatCtGGGtCatCttCtC3′，产物长度353bp.pCR产物经琼脂糖电泳后于FR200图像分析系统分析.
1.2.6KDRsiRna转染细胞KDR蛋白表达的westernblotting检测转染后72h，提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行SDSpaGe电泳，电泳完毕后，marker的条带进行考马斯亮兰染色，余下的胶按操作说明装入电转印仪，100V电转45min后加50g/L脱脂奶粉封闭；加1/1000pBS稀释的KDR抗体，4℃孵育过夜；pBStween洗涤，加1/1000稀释的二抗室温60min；pBStween洗涤后DaB显色30min，于FR200图像分析系统分析结果.
2结果
2.1KDRsiRna片段的获得合成的KDRsiRna寡核苷酸片段退火后得到约66bp的Dna片段，提示退火成功.
2.2pSilencertm3.1/KDRsiRna重组质粒的构建及鉴定酶切后的琼脂糖电泳图可见一大小为66bp左右的酶切片断，与设计合成的KDR基因特异性序列大小相符（图1）.将各重组质粒分别命名为pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2，pSilencer3.1KDR3，阴性对照质粒命名为pSilencer3.1nC(negativecontrol).Dna序列测定结果表明，各序列已成功插入了pSilencertm3.1H1neo载体（图2）.
m:Dnamarker；1：pSilencer3.1KDR1；2：pSilencer3.1KDR2；3：pSilencer3.1KDR3；4：pSilencer3.1H1neo.
图1重组pSilencertm3.1/KDRsiRna表达载体的双酶切鉴定（略）
2.3转染效率的观察转染后24h，经荧光倒置显微镜下观察peGFpn2质粒同步转染的pC3，结果显示，此次转染的效率约为60%~70%.
2.4KDRsiRna转染细胞的RtpCR鉴定将构建好的KDR的Rnai载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3以及pSilencer3.1nC以脂质体分别转入pC3前列腺癌细胞，提取各组细胞总Rna经RtpCR扩增KDR片段，琼脂糖凝胶电泳结果(图3)显示，pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2重组质粒转染的pC3细胞KDR的mRna水平变化不明显，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的pC3细胞的KDRmRna水平较亲本细胞和阴性质粒转染细胞明显下调，抑制率约为55%.
a:pSilencer3.1KDR1；B：pSilencer3.1KDR2；C：pSilencer3.1KDR3.
图2重组pSilencertm3.1/KDRsiRna表达载体插入片断的测序结果（略）
m:Dnamarker；a1：pSilencer3.1KDR1；a2：pSilencer3.1nC；a3：pC3；a4~a6：βactin;B1：pSilencer3.1KDR2；B2：pSilencer3.1nC；B3：pC3；B4~B6：βactin;C1：pSilencer3.1KDR3；C2：pSilencer3.1nC；C3：pC3；C4~C6：βactin.
图3KDR表达的RtpCR鉴定2.5KDRsiRna转染细胞的westernblotting鉴定提取pC3，pSilencer3.1nC，pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3（略）
各组细胞总蛋白，行westernblotting检测，鉴定结果见图4.由图4可见，亲本细胞、阴性质粒转染细胞pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2重组质粒转染的pC3细胞KDR的蛋白总量水平无明显差别，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的pC3细胞，KDR蛋白总量明显下调，抑制率约为55%.
1:pSilencer3.1KDR1;2:pSilencer3.1KDR2;3:pSilencer3.1KDR3;4:pSilencer3.1nC;5:pC3.
图4KDR表达的westernblotting鉴定（略）
3讨论
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VeGF)及其受体在肿瘤血管形成中起着关键的调节作用［4-5］，能刺激血管内皮细胞分裂、增殖，诱导血管生成，有助于肿瘤的生长和转移.VeGFR家族的成员包括：VeGFR1（Flt1），VeGFR2（KDR/Flk1），VeGFR3（Flt4）.KDR是发挥功能的主要受体，它不仅表达于肿瘤组织的血管内皮细胞，而且表达于肿瘤细胞的胞膜和/或胞质，提示肿瘤细胞分泌的VeGF不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞并诱导血管新生，也可通过自分泌途径与自身表面的受体结合而促进细胞生长或迁移，从而抑制细胞凋亡.研究表明阻断VeGF与KDR的相互作用能抑制动物体内实体瘤的生长，达到治疗肿瘤、抑制肿瘤生长的目的.witte等［6］制备的可与KDR特异性结合的单抗DC101，在体外能抑制VeGF与受体的结合，阻断VeGF诱导的信号传导.Bruns等［7］用DC101治疗前列腺转移直肠癌小鼠模型，发现该治疗不仅抑制小鼠肿瘤血管的生成，而且导致肿瘤内皮细胞的死亡.这些结果表明抑制肿瘤细胞和/或肿瘤血管内皮细胞上VeGF受体的表达，不仅可阻止肿瘤细胞的生长，也可抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的生长和转移.
Rnai技术是指一短双链Rna(21bp)可使具有同源结构的Rna降解，它是近年来新发现的一个强大的基因研究工具.将具有反向重复序列的Dna模板克隆至Rna聚合酶Ⅲ(polⅢ)转录单位中，以质粒Dna为载体转染哺乳动物细胞，利用细胞中Rna聚合酶持续转录合成Rna，这种Rna内部互补折叠形成短发卡样dsRna，被Rna酶样物质(Dicer)切割形成21或23个碱基的双链Rna，即siRna.由于类似于天然的siRna，同反义核酸技术和单链Rna相比，siRna更有效，可在更长的时间内抑制靶基因的表达［8］.
人前列腺癌组织中有VeGF和KDR表达，且VeGF和KDR表达与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关.我们成功构建了3个针对KDR基因的重组转录载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3.转染KDRsiRna的pC3前列腺癌细胞，72h后KDRmRna及蛋白表达下调，而以pSilencer3.1KDR3的抑制效果最为明显，抑制率约为55%.构建的Rna干扰表达载体能明显干扰KDRmRna及蛋白的表达，为进一步研究KDR的功能以及应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.
参考文献
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单细胞生物定义篇8
【摘要】目的:探讨诱骗受体3（DcR3）对人肺成纤维细胞（HLF）合成Ⅳ型胶原的作用。方法:overpCR方法构建DcR3的真核表达载体，脂质体法转染HLF细胞，westernblot检测HLF细胞合成Ⅳ型胶原的含量。结果:成功构建了pvax1DcR3真核表达载体并转染HLF细胞;转染组细胞ColⅣ表达量明显升高，从12h开始持续到72h，与对照组比较差异有统计学意义（p0.05）;转染组不同时间ColⅣ表达量有统计学意义（F=34.25，p
【关键词】DcR3基因;HLF;Ⅳ型胶原
诱骗受体3(decoyreceptor3，DcR3)是一个新发现的具有免疫抑制作用的分子，与多种自身免疫性疾病、肿瘤、弥漫性肺间质疾病等相关［1，2］。有文献报道DcR3在肺纤维化患者外周血单核细胞中高度表达［3］，但是DcR3在肺纤维化的发病过程中，到底扮演怎样的角色，目前尚不明确。本研究拟通过检测分析转染DcR3后，肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原的能力，探讨DcR3对肺纤维化形成的作用。
1材料和方法
1.1材料人肺成纤维细胞（humanlungfibroblast，HLF）购自上海细胞研究所。真核表达质粒pvax1购自天根公司;原核表达质粒pet28a（+）DCR3（含酶切位点BamHi和ecoRi），为本室构建并保存。mouseantihumanDcR3自备。小鼠抗人ColⅣ单克隆抗体(mab)和相应二抗及DaB显色液购自武汉博士德生物试剂公司。pCR引物、primerStaRtmHSDnapolymerase、DH5αe.coli感受态细胞、Dna连接酶、限制性内切酶BamHi和ecoRi、核酸分子质量标准、购自天根公司;Lipofectaminetm2000脂质体、细胞培养试剂购自invitregen公司;质粒抽提试剂盒购自美国promega公司;pVDF膜购自Roche公司，Rpmi1640培养基细胞培养试剂购自Sigma公司。
1.2方法
1.2.1引物设计与合成参考GenBank收录的DcR3序列和信号肽序列（aF104419），设计引物如下:a1:5′CGGatCCaGCatGGCCCtGtGGatGCGCC3′（斜体为BamHi酶切位点）;a2:5′CaGGGGtaGGtGGGtGtttCtGCCaCGGCtGCGGCtGGGtCaGGtC3′;B1:5′GaCCtGaCCCaGCCGCaGCCGtGGCaGaaaCaCCCaCCtaCCCCtG3′;B2:5′CCGaattCtCaGtGCaCaGGGaGGaaGCG3′（斜体为ecoRi酶切位点）上述引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。
1.2.2pCR扩增人DcR3cDna通过overlappCR方法将信号肽和目的基因相连，扩增出完整的DcR3cDna。具体如下:以含信号肽质粒为模板，以a1、a2为引物扩增信号肽序列;以含目的基因质粒为模板，以B1、B2为引物扩增目的基因;以1和2步骤中产物为模板，以a1和B2为引物扩增即得到含信号肽的目的基因序列。循环条件为:94℃45s，63℃90s，72℃1min，共进行35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
1.2.3DcR3重组质粒的构建和鉴定taKaRa胶回收试剂盒回收pCR产物。提取质粒载体pvax1，然后用BamHi和ecoRi对质粒和纯化后的pCR产物分别进行双酶切。酶切产物用taKaRa胶回收试剂盒回收，紫外分光光度计上测定载体和pCR两种双酶切产物量。然后按10∶1(DcR3∶pvax1)的摩尔比混合，16℃连接反应过夜。将连接产物转化感受态DH5α，氨苄平板筛选。取阳性单克隆进行扩增，抽提重组pvax1DcR3质粒进行BamHi和ecoRi双酶切，然后在20g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入。鉴定正确的克隆送上海生工生物公司测序。
1.2.4HLF细胞培养HLF细胞培养采用100mL/LFCS培养液和条件培养液联合培养（1∶1）。条件培养液制备:取5只2周龄博莱霉素法制备的大鼠肺纤维化模型，用9mL/L生理盐水灌洗肺脏(1.5mL/次×4次)，收集灌洗液，1000r/min离心10min，弃上清，将沉淀细胞用含100mL/LFCS的Rpmi1640培养液于50mL/LCo2培养箱37℃培养2h，使巨噬细胞贴壁。改用含2mL/LFCS的培养液(5mL/瓶)继续培养24h，收集上清作为条件培养液［4］。
1.2.5pvax1DcR3转染HLF细胞采用Lipofectaminetm2000脂质体转染，将质粒4μg/孔用500μL无双抗、无血清的Rpmi1640培养液稀释;将10μL脂质体用500μL无双抗、无血清的Rpmi1640培养液稀释，静置5min;混合Dna和脂质体，室温放置20min;细胞用1×pBS洗2遍，加400μL无双抗、无血清Rpmi1640培养液;将Dna和脂质体混合物逐滴加至细胞上，轻轻摇匀，37℃孵育;4h后换成含联合培养基继续培养。细胞分组:转染组、对照组、转染＋抗体组。
1.2.6ColⅣ胶原检测(westernblot)细胞转染处理后，于12、24、48、72h收集细胞，提取细胞总蛋白，制备75g/L分离胶进行电泳，每孔加蛋白20μg，上样总体积20μL，pVDF转膜，100g/L脱脂奶粉封闭3h，加入小鼠抗人ColⅣmab(1∶500稀释)，同时做βactin内参照;4℃摇床过夜;加入生物素标记的二抗(1∶4000)，摇床常温孵育1h，X光底片曝光，显影及定影，对电泳条带扫描及图像分析，得出条带的平均吸光度(a)。试验重复3次。
1.2.7统计学分析数据以x±s表示，采用SpSS13.0统计软件，包括单因素方差分析和多组间两两比较的LSD检验。
2结果
2.1重组质粒pcDna3.1(+)DcR3的双酶切鉴定20g/L的琼脂糖凝胶电泳结果显示，重组质粒pvax1DcR3经BamHi和ecoRi双酶切，可切出2个片段，大片段迁移率与空质粒双酶切后的片段一致，约为2972bp;小片段迁移率与设计片段一致，约为901bp(图1)。
图1pvax1DcR3酶切鉴定结果
m:DL2000Dnamarker;1，3:质粒pet28a（+）DcR3;2，4:经BamHi和ecoRi双酶切pvax1DcR3.
2.2pcDna3.1(+)DcR3重组载体测序及序列分析结果Dna测序结果显示，重组质粒含有901bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。
2.3DcR3对HLF合成ColⅣ的促进作用经westernblot检测(图2)和图像分析(电泳分离条带的平均吸光度a值)证明，DcR3转染人肺成纤维细胞后，转染组细胞ColⅣ表达量明显升高，从12h开始持续到72h，与对照组比较差异有统计学意义（p＜0.01）;而转染组+抗体组与对照组比较差异无统计学意义;转染组不同时间ColⅣ表达量有统计学意义（F=34.25，p＜0.05，表1）。说明DcR3的表达增强了HLF合成胶原的能力。
3讨论
弥漫性间质性肺疾病（iLD）是肺内弥漫性成纤维细胞过度增生和细胞外基质过度沉积的一组疾病，虽然引起iLD病因不同，但其发病都从肺泡炎开始，最终发展为肺间质纤维化。目前认为iLD发病的主要过程如下:在不同病因作用下肺泡上皮和血管内皮及血液蛋白成分露出，形成肺泡炎的初始阶段;病变进一步发展使炎症细胞、免疫效应细胞进入肺内并释放介质;在前述细胞及释放介质的作用下，成纤维细胞活化、增殖及生成胶原和细胞外基质。肺内成纤维细胞活化的结果就是合成Ⅰ、Ⅲ型胶原的能力增强，胶原的沉积导致呼吸膜增厚直至取代肺泡组织［5］。
用博莱霉素制备的2周大鼠肺纤维化模型恰好是肺泡炎阶段，我们利用这个阶段的大鼠肺泡灌洗液制备条件培养液，就是为了模拟iLD发病的主要过程，这样我们的结果更能具有指导临床的作用。前期工作中我们通过亚克隆的方法构建了重组原核表达质粒pet228a(+)/DcR3，表达了DcR3蛋白并制备了mab［6］。但是，该质粒中DcR3序列（825bp）不含信号肽，为了在HLF中表达这个基因，我们用overpCR方法把信号肽连接到DcR3序列（825bp）上，构建了DcR3的真核表达载体pvax1DcR3。pvax1DcR3转染HLF后ColⅣ表达量明显升高，从12h开始持续到72h，与对照组比较差异有统计学意义（p
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单细胞生物定义篇9
采用全自动血细胞分析仪对作业工人进行外周血象检测。主要检测指标有白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、中性粒细胞。评价标准车间空气评价标准按GBZ2-2007工作场所有害因素职业接触限值:苯＜10mg/m3，甲苯＜100mg/m3，二甲苯＜100mg/m3。白细胞降低指白细胞总数＜4.0×109/L;红细胞减少指红细胞总数男性＜4.0×1012/L，女性＜3.5×1012/L;血红蛋白降低指血红蛋白男性＜120g/L，女性＜110g/L;血小板减少指血小板总数＜60×109/L;中性粒细胞减少指中性粒细胞绝对值＜2×109/L。资料整理与统计方法应用SpSS13．0统计软件分析包进行分析，并进行描述性统计，卡方检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2．1环境条件测量结果
对该鞋厂各生产空间中的空气进行三苯含量检测，车间空气各监测点苯，甲苯，二甲苯浓度均远低于国家卫生标准限值(苯＜10mg/m3，甲苯＜100mg/m3，二甲苯＜100mg/m3)，其中苯的平均浓度为0.15mg/m3，甲苯平均浓度为0.38mg/m3，二甲苯浓度基本＜0.07，故为低浓度混苯作业环境，主要为接触苯及甲苯。
2．2外周血检测结果
与对照组比较，低浓度混苯暴露组wBC异常率、中性粒细胞绝对值异常率差异有统计学意义(p＜0.05)，RBC、Hb、pLt差异无统计学意义。wBC异常的年龄分组卡方检验结果差异有统计学意义(p＜0.05)，＜30组wBC异常率较高;wBC异常的性别分组差异无统计学意义(表2、3)。中性粒细胞异常的年龄分组卡方检验结果差异有统计学意义(p＜0.05)，＜30岁组中性粒细胞异常率较高;中性粒细胞异常性别分组差异无统计学意义(表4、5)。
3讨论
苯及其苯系物广泛应用于油漆、制鞋箱包、印刷等行业，但长期接触高浓度苯可以引起职业性急、慢性苯中毒。一般认为苯的毒性是通过代谢产物产生〔1〕，苯在环境中以蒸汽形式由呼吸道和皮肤进入人体，通过肝微粒体上的细胞色素p450(CYp)代谢成各种苯醌和氢醌，集中在骨髓发挥毒性作用，主要包括影响Dna合成，诱导干细胞凋亡，促进血细胞破坏，干扰促红素的刺激作用和影响造血微环境，引起再生障碍性贫血或骨髓增生不良，最终导致急性髓性白血病。目前国内大部分工人接触的作业场所，以低浓度混苯为主，有文献报道低浓度苯暴露对wBC异常具有一定的积累作用〔2，3〕，对苯作业进行体检发现〔4〕，慢性低剂量的苯及苯接触者可导致外周血细胞减少，甚至可影响造血干细胞的正常造血功能。资料发现〔5〕低浓度苯暴露红细胞计数仍在正常范围，但wBC计数下降，暴露2年可引起wBC计数下降0.41单位。低浓度苯暴露1年可引起RBC下降0.18单位，低浓度苯暴露2年RBC基本恢复正常水平。有关苯的动物实验表明〔6〕，苯对大白鼠wBC的影响需要一定的时间和一定的剂量，苯积累量少或短时间暴露，对wBC影响不明显。慢性苯中毒对人体的危害是严重的，不可逆的，目前尚没有有效的治疗方法，故最重要的是做好预防和检测工作，而目前职业性苯接触工人血常规检查是健康监护最重要的方法〔7〕。林丽蓉等报道〔8〕，长期接触三苯胶(含苯、甲苯、二甲苯)可导致作业工人白细胞、血细胞和血小板降低。沈海福等报道〔9〕苯作业工人白细胞异常率升高，但也提示苯作业可能会影响工人的neUt%、LYmpH%、HGB、eo%等血象指标，使其异常率升高，性别分层比较提示苯作业工人血象指标异常与接苯工龄有密切关系，且苯对女性的危害比男性更为严重。陈俐枫报道〔10〕，长期接触苯系物对造血系统有明显的损害，尤其是对白细胞的影响最为明显，对血小板也有一定的影响，刘月红等报道〔11〕，对某鞋厂的调查显示，wBC减少的异常率接触组比对照组高。
单细胞生物定义篇10
【关键词】单核细胞趋化蛋白1；单核细胞趋化蛋白1受体；胶质瘤；血管生成作用
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.22.035
胶质瘤是人体血管化程度最高的肿瘤，其具有高复发率的临床特点，新生的血管不仅为肿瘤的生长提供营养支持，还构成了肿瘤侵袭的途径，单核细胞趋化因子mCp-1是CC趋化因子超家族重要成员，在肿瘤细胞中可高表达mCp-1及其受体CCR-2[1]。研究表明小胶质细胞及巨噬细胞中CCR-2表达升高[2]。本研究提出胶质瘤细胞可能通过mCp-1/CCR-2途径改变胶质瘤血管生成的微环境，参与胶质瘤细胞侵袭，从而更好的解释CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用机制。
1材料与方法
1.1主要试剂、细胞与仪器试剂：胶质瘤细胞系n9细胞（中国科学院细胞库），含血清的完全培养基及不含血清培养基（美国GiBCo公司），pCR试剂盒（上海硕盟生物），免疫组化试剂盒（武汉博士德），HRp标记山羊抗小鼠igG，HRp标记山羊抗兔igG（上海碧云天生物），含eDta的胰酶（美国GiBCo公司），一抗：VeGF、iL-8兔单克隆igG和β-actin小鼠多克隆igG（美国SantaCruz公司）。仪器：细胞培养超净台（苏州净化），培养箱（美国Queuesystems），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），高转速冷冻离心机（德国BiofugeStratos），-80℃-4℃冰箱（日本松下），高压消毒箱（美国tuttnauer），转膜仪及电泳仪（美国伯乐公司），pCR仪（澳大利亚Rotor-gene）。
1.2细胞培养与传代胶质瘤细胞系n9细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的Dmem培养基中，置于5%Co2、37℃孵箱中传代培养。当细胞密度达到4×106以上的时候进行传代，清洗培养基后，用含0.02%eDta的胰蛋白酶进行细胞消化，倒置显微镜观察细胞回缩即终止消化，加入同体积的有血清培养基，吹打，5min10000r/min离心，弃上清，取细胞悬液，计数后接种到新的培养瓶中。
1.3CCR2活化待细胞贴壁生长至4×106，对照组细胞用常规培养基，观察组运用mCp-1处理细胞，50ng/mLmCp-1分别于0、12、24、36、48h诱导活化，提取培养上清用于检测VeGF、iL-8蛋白分泌情况，细胞用于提取Rna，以分析VeGF、iL-8mRna的表达。
1.4免疫组化方法采用Sp检测法，加入3%过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，50μL非免疫动物血清封闭，加50μLVeGF、iL-8一抗过夜，50μL生物素标记第二抗体，辣根过氧化物酶孵育，DBa显色，苏木素复染，中性树胶固封。结果判定：阳性细胞为细胞胞浆胞膜在倒置显微镜下出现深棕黄色的染色。
1.5Rt-pCR（半定量逆转录聚合酶链反应）方法提取总Rna。取2μg总Rna行逆转录cDna，取20μL作为反应体系。pCR反应由逆转录产物2μ以及18sRna和VeGF、iL-8的引物共同组成。反应过程按照标准的Rt-pCR步骤进行：首先预变性的反应条件为95℃、5mins，接着进行梯度变性反应，共进行30次的循环。接着对所得到的pCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍摄电泳图像对所得到的电泳结果进行凝胶成像分析系统分析。内参选择18sRna作为参照，同样完成以上pCR系统的成像，对得到的半定量结果进行对比分析，通过量化的吸光度积分值进行分析（a值）。
1.6westernblotting方法提取上清蛋白。SDS-paGe凝胶电泳，半干法转膜，加VeGF、iL-8一抗（1∶500），4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶1000）37℃孵育1h。eCL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。
1.7统计学处理所有采集的数据使用SpSS21.0统计软件进行分析。其中对符合正态分布资料的数据采用（x±s）表示，对非正态分布数据采用中位数和四分位数间距来表示。遵循正态分布而且方差齐性，两两比较采用LSD检验。非参数检验法对不同时间所表达的mRna的量和蛋白的量进行比较，应用Kruskal-wallisH检验进行多组间数据的比较，应用mann-whitneyU检验法进行数据比较，具有统计学差异的以p
2结果
2.1免疫组化法检测CCR-2在胶质瘤细胞系n9细胞中表达情况取5张片，每张片取5个视野，取平均值。阳性表达以细胞核着色为主，其阳性细胞数评分：75%计为4分；染色的着色评分：不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最后的结果评判阳性率和着色的强弱相加之和为总得分，0分的计为阴性组“-”，1～2分的计为弱阳性组“+”，3～4分的计为阳性组“++”，5～7分的计为强阳性组“+++”。CCR-2在胶质瘤细胞系n9细胞中有较高的阳性表达，共46个细胞，-4个，+15个，++17个，+++10个，占91.30%。
2.2Rt-pCR检测mCp-1活化CCR2后VeGF和iL-8mRna表达水平经过活化之后可以增加n9细胞的VeGF和iL-8mRna表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义（p
2.3通过westernblot法检测mCp-1活化CCR2后VeGF和iL-8的蛋白表达水平经过活化之后可以增加n9细胞的VeGF和iL-8蛋白表达水平，与未活化组比较差异具有统计学意义（p
3讨论
胶质瘤是人体血管瘤中一种复发率较高的肿瘤，以新生血管的快速增长为主要病理特征，新生血管不仅给肿瘤提供营养支持还可以构成肿瘤外周组织侵袭的途径[3]。单核细胞趋化蛋白1-mCp-1是CC趋化因子超家族的主要成员，其受体为CCR2。已有研究表明两者与肿瘤细胞浸润有着密切的关系[4]。胶质瘤患者的脑脊液中存在mCp-1及CCR2的高表达，过表达CCR2还存在于胶质瘤祖细胞中，因此本研究通过探讨单核细胞趋化蛋白1（mCp-1）受体CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用，为更好的研究其在肿瘤复发中的机制。
血管的生成在肿瘤的转移、侵袭中发挥着重要的作用，但是其始动细胞一直是肿瘤血管生成的关键科学问题[5]。VeGF和iL-8是两种重要的促进血管生成因子，可直接刺激内皮细胞表面的受体，发挥内皮细胞生成、增殖及迁移的作用[6]。本研究结果显示，CCR-2在胶质瘤细胞系n9细胞中有较高的阳性表达，经过活化之后可以增加n9细胞的VeGF和iL-8mRna及蛋白表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义。研究提示，胶质瘤细胞中CCR2活化可以促进血管内皮因子及白细胞介素-8的表达，进而具有促进血管生成的作用。胶质瘤形成是CCR2通过mCp-1活化发挥血管生成作用的。
综上所述，胶质瘤的生成中促血管生成因子之间的调控是关键因素，在今后的抗肿瘤药物研发方面应将促血管生成因子考虑到其中，更有效地抑制血管地生成，更好地发挥对肿瘤生长发展和迁移的抑制作用。
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