微生物学研究方法篇1
[关键词]微生物分子生态学RFLpDGGeReal-timepCR
[中图分类号]Q938.1[文献码]B[文章编号]1000-405X（2015）-2-267-1
0引言
微生物分子生态学是利用分子生态技术手段研究微生物与环境之间相互关系及其相互作用规律的科学，主要研究微生物生态学基础理论问题。
1微生物分子生态学常用分析方法
1.1寡核苷酸探针检测
该方法利用目标核酸序列与特异性探针特异性互补的特点，检测荧光标记的特定Dna序列[1]。探针为一段特定方式标记的核酸序列，具有较高灵敏度。做种群鉴定时选用Dna制备探针，利用cDna避免繁琐的克隆程序，确保探针与种内全部菌株杂交。除此之外，cDna探针若具有表型特异性，则可检测某一特定表型是否存在。
1.2Dna-Dna杂交
Dna-Dna杂交针对微生物整体基因组的重组[1]，为检测Dna序列相似性提供可能性。该方法基于高温双链Dna解链、低温复性与碱基配对可转移的特点，通过温度等条件控制形成杂交Dna，检测其杂交率。由于来源不同的两条Dna单键难以配对重组，Dna杂交率可用于估计序列相似度。
1.316SrRna序列分析
该方法在微生物分类学研究中最为常用[2]。微生物16SrRna基因由保守区与可变区构成。可变区具有种属特异性，不同种属微生物间存在较大差异；保守区为所有微生物共有基因序列。微生物进化过程中，基因序列基本不变化，因此可根据保守区基因序列设计通用引物，或根据可变区基因序列设计特定引物，从而分析不同微生物的进化距离及亲缘关系。
1.4编码蛋白质基因
该方法利用基因序列控制合成蛋白质[3]。微生物代谢过程实质为生物酶催化作用下的一系列氧化还原反应，而不同功能微生物的催化反应酶具有一定特异性，因此编码功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理学方面。
2微生物分子生态学常用技术
2.1限制性片段长度多态性分析（RFLp）
在RFLp分析过程中，以所提取的微生物Dna为模版，利用特异性引物进行聚合酶链式反应（pCR）得微生物16SrRna序列，将其连接到载体，转至大肠杆菌感受态细胞，通过挑取克隆子，进而获取质粒Dna来实现克隆文库构建。不同微生物Dna序列不同，进而酶切位点不同，因此利用特异性限制性内切酶消化，可得到长短不一、数目不同的限制性酶切片段，琼脂糖凝胶电泳分离得到呈现多态性的图谱，进而获取环境微生物群落结构信息[4]。
2.2变性梯度凝胶电泳技术（DGGe）
DGGe是一种检测Dna突变的电泳技术，根据Dna在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将碱基组成不同的Dn段分开。该技术具有以下优点：①检测极限低、速度快；②结果准确可靠；③无需微生物的培养；④可同时检测多种微生物。但其存在以下局限性：无法获取样品中全部微生物Dna，而Dna回收率越低，重复性越低；不均等扩增造成结果代表性低；敏感度较低，采样和样品处理会对结果产生影响。
2.3荧光定量pCR技术（Real-timepCR）
Real-timepCR为微生物生态学研究的定量分析方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪pCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析产物，计算模板浓度。该技术具有以下优点：①利用扩增产物数量与荧光信号强度成对应关系的原理，实时检测pCR反应进程，避免了终点定量重现性差；②自动化程度高，操作安全、简单，可避免产物被污染；③检测特异性强，灵敏度与精确度高；④可实现多重扩增。其缺点在于无法对不确定对象进行分析。
3结论与展望
微生物分子生态学克服了传统培养法的不足，为全面掌握微生物多样性提供了可能。若将各方法结合，以便掌握更为全面的信息，可更好揭示微生物对环境变化的影响，预示环境变化趋势，为从微观方面改善环境提供依据。
参考文献
[1]杨霞，陈陆，王川庆.16SrRna基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（2）：55-60.
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微生物学研究方法篇2
关键词：土壤微生物；高通量测序；生物多样性
中图分类号：S154.37文献标识码：a文章编号：16749944（2013）08020303
1引言
土壤是一个非常复杂的生态环境体系，土壤微生物学作为微生物学的一个分支，一直在研究之中。土壤微生物是土壤的重要组成部分，是生态系统中重要的消费者和分解者，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了土壤的质量和稳定性。土壤微生物多样性是指微生物生命的丰富性及在遗传、种类、生态系统层次上的变化，同时反映微生物群落的稳定性。许多研究已经证实，通过传统的Dna分离方法测定出来的土壤微生物只占到环境微生物的0.1%～10%[1，2]。传统的土壤微生物研究方法如微生物平板培养法、Biolog鉴定系统法、生物标记法等[3]往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，无法详细描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。随着科学技术的发展，传统的Sanger技术的弊端也日益体现，一方面是因为该方法费时，且一次的反应数有限，另一方面是该技术基于酶法测序，成本较高。随着微生物研究技术的迅速发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学研究专家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法[4]，高通量测序技术也随之诞生，慢慢应用到科研之中。
2土壤微生物研究方法
2.1微生物平板培养法
传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。这种方法只能培养出极少量的微生物类群，大约占0.1%～10%，无法对绝大多数土壤微生物的分类和群落结构进行深入研究。因此这种培养法局限性比较大，只能应用于特殊微生物的研究[5]。
2.2BioLoG鉴定系统
BioLoG系统是Garland于1991年建立起来的一套用于研究土壤微生物群落结构和功能多样性方法。细胞的维持和生长需要能量、碳源和多种无机离子，底物利用是群落中微生物存活和竞争的关键。因此可以根据微生物对碳源利用的方式来鉴定微生物的群落结构。碳数利用法通常用BioLoG盘来实现。BioLoG测试盘内有96个小孔，除了一个小孔为对照不含碳源外，其余都含不同的碳源。试验中将碳源和指示剂一起放入平板小孔内，然后将稀释后的细胞悬液接种到各个小孔中，由于微生物利用碳源引起指示剂变化，以此来检测和判断不同土壤微生物群落结构[6]。
2.3分子生物学技术测序方法
在过去的20多年里，分子生物学技术尤其16SrDna技术已经广泛应用于鉴定未知菌类的研究中。20世纪80年代以来，逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法，如pCR-RFLp、pCR-RapD、pCR-SSCp、荧光原位杂交技术（FiSH）、基因芯片（microarry）、磷脂脂肪酸图谱分析（phospholipidfattyacid，pLFa）、稳定同位素探针（Stableisotopeprobing，Sip）、pCR-DGGe/tGGe等[7]，使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。
但是这些技术只能在科或属水平上分析土壤微生物的群落结构，不能更细致更详细地对土壤微生物进行分析研究。随着科学技术的发展，相继出现了第一代、第二代、第三代高通量测序技术，使得研究人员能在种的水平上对土壤微生物进行研究和分析。
2.4454高通量测序方法
高通量测序技术[8]是传统测序一次革命性的改变，一次可以对几十万到几百万条Dna分子进行序列测定，在有些文献中也称其为下一代测序技术（nextgenerationsequencing），可见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。
近年来，以16SrRna/Dna为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法。研究表明，400～600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[9]，因此454高通量测序的方法因其读长（400～500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。
因此通过高通量测序法来确定土壤微生物群落结构，从而可以在种的水平上将土壤微生物的群落结构分析出来，然后就可以对土壤微生物的多样性进行分析。并可以对土壤微生物和盐生植被的相互照应关系进行分析研究。
3454高通量测序在土壤微生物研究中的应用
3.1研究土壤微生物的物种多样性
研究微生物物种多样性主要从微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数目及其比例来描述某个地区某段深度土壤中微生物的多样性，然后根据此地区土壤微生物物种的多样性来探究全球范围内土壤微生物的物种多样性。通过高通量测序测得土壤中土壤微生物的各种菌类组成，以此来研究某个地区土壤中微生物的物种多样性。
3.2研究土壤微生物的功能多样性
研究土壤微生物功能多样性主要从各种微生物的活性及它们的相互作用产生的功能、底物代谢能力及与n、p、K等营养元素在土壤中相互转化的功能等。通过将高通量测序得到的土壤微生物的群落结构及组成和实验测定土壤的几种理化性质及转化过程来了解土壤微生物的功能。
通过实验测得土壤的碱解氮、有效磷、活性有机质、腐殖质理化性质，可以分析地区土壤微生物的功能多样性，以此来探究全球范围内土壤微生物乃至整个微生物的功能多样性。
3.3研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响
环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。近几年来随着全球变暖，土壤微生物的群落结构可能发生了变化，地震、泥石流等自然灾害也会对土壤微生物的群落构成产生影响。Zachary等以重水稳定同位素探测技术（H218o-Sip）鉴定与土壤增湿相关的细菌。先对土壤增湿前土壤微生物进行测定，得到土壤微生物各种组成，然后将土壤增湿后，对土壤中16SrRna进行高通量测序，发现alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究，划分生态类群。除此之外，温度的骤变也会对土壤微生物菌群产生巨大的影响。
4454高通量测序技术存在的问题及发
展前景到目前为止，大量的研究者应用454测序技术对多种环境样品的微生物多样性进行了深入研究，这些研究大大增长了人类对微生物的存在和种类的认识。针对不同的研究对象，454测序技术不仅为研究提供了大量数据，证实研究对象所含微生物具有较高的多样性，而且还建立了一种研究复杂生态系统里的微生物多样性方法。但由于该技术刚刚起步，所以存在一些待解决的问题。首先，随着核酸序列数量上的跨越式累积，生物信息学分析将面临巨大的挑战。另外，海量数据的深入挖掘工作会发现用传统生物学理论难以解释的生命规律，对传统理论的颠覆和新理论的提出与建立将成为不可避免的工作。
虽然存在许多不足，但454测序技术仍以其强大的测序能力渗透到生命科学研究的方方面面，包括那些此前无法用测序来解决的领域。在微生物领域，凭借着454测序技术各方面的优势，终究会成为未来研究环境基因组的主导测序技术，同时，随着454技术的不断完善，该技术将为微生物生态学研究注入新的动力，成为微生物生态学研究新的亮点，大大加速微生物生态学的发展，增长人类对微生物生态学的认识，为人类探索广袤的微生物资源提供无限遐想。参考文献：
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[5]HuangYanxia.Researchprogressonsoilmicrobialdiversityanalysistechnology[J].Journalofanhuiagriculturalsciences，
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微生物学研究方法篇3
关键词：昆虫肠道；微生物；多样性
引言
昆虫肠道是微生物分布的一类特殊生境，存在种类繁多、数量庞大的微生物。昆虫肠道系统受多变的环境影响，因此这类微生态具有多样性，该多样性与昆虫种类、食性、杀虫剂抗性机制、宿主的生理功能等密切相关。近年来，随着社会发展，社会对环境保护高度重视，这促进了昆虫肠道微生物研究，同时测序技术高速发展，为该研究提供了技术支持。已经有很多学者着手研究昆虫与肠道微生物的共生关系。
1昆虫肠道微生物的种类及研究方法
肠道微生物可分为常驻群落和过路群落，常驻菌群是在昆虫肠道中长期存在的；过路菌群是指不能在健康的动物肠道里长期停留的菌群。同时菌群可分为益生菌和病原菌，在数量上占有绝对的优势的菌群基本均为常住菌群和益生菌。有些肠道微生物能够与昆虫互利共生则为共生菌，包括兼性共生菌和专性共生菌，有些肠道微生物会对昆虫的生长发育造成明显影响，甚至可能导致寄主死亡，为寄生菌。
昆虫肠道微生物多样性检测方法包括传统培养检测方法、分子检测的方法（16SrRna基因的分子检测方法、基于宏基因组学的检测方法等）。其中由于16SrRna基因的分子检测操作相对简单，可以作为昆虫肠道微生物检测和鉴定的首选方法。
2昆虫与微生物互作的研究意义
2.1提供营养物质
昆虫肠道中的微生物，含有多种酶系统，参与代谢，在昆虫的生化反应中起着重要作用。已有报道证实了肠道微生物能合成特定的氨基酸、合成类脂、维生素、并含有固氮作用，如根瘤菌。有时肠道微生物本身也可以成为昆虫的食物，为昆虫提供营养物质。
2.2挖掘具有特殊功能的微生物资源
昆虫与微生物互作的研究，有利于从昆虫肠道这一特殊生境中挖掘具有特殊功能的微生物资源。现已有研究，进行昆虫肠道微生物的分离，以产生高活性生物活性物质为筛选目标，筛选获得有重要应用价值的微生物菌株，如产抗菌、抗肿瘤、特殊酶等活性物质的微生物菌株，分离纯化所产生物活性物质，研究活性物质组成和特性，优化活性物质产生条件，更好地开发微生物资源以及利用生物活性物质。
2.3昆虫与肠道细菌的免疫互作
肠道细菌与昆虫的免疫系统的存在着相互作用。免疫的作用机制对害虫的生物防治具有重要的意义。宿主昆虫与肠道细菌的免疫互作，是肠道细菌研究的一个难点。其免疫的机制可以用于抵御外来病原微生物的入侵，同时又能抑制肠道微生物的过度增殖。从中也不难看出，在长期的发展中，肠道细菌与昆虫的共生关系达到一种协同作用，相互妥协，两者在免疫系统上的相互作用促进了各自的发展。
3昆虫肠道微生物多样性的影响因素
3.1摄取的食物
昆虫种类的多样使得其肠道环境也有多样性。肠道是昆虫的重要消化场所，肠道微生物菌能对特定食物进行代谢、降解。不同的昆虫食性不同，摄取的食物种类也有所不同。研究表明，小菜蛾成虫中肠道内阿氏肠杆菌含量较高，而阴沟肠杆菌较少，小菜蛾幼虫专性取食十字花科植物，成虫主要取食蜂蜜，这可能是小菜蛾肠道微生物多样性改变的原因之一，即食性的改变。
3.2宿主的生理功能
通^研究暗黑鲍金龟成虫肠道、卵以及不同龄期幼虫后肠内微生物的群落组成，可以观察到暗黑银金龟，在不同发育阶段的肠道微生物分子多态性。证实了宿主的生理功能的确影响昆虫肠道微生物多样性和分子的多态性。
3.3杀虫剂抗性机制
昆虫杀虫剂抗性机制与昆虫肠道微生物的多样性有关，昆虫利用肠道微生物对杀虫剂产生抗性，昆虫肠道内若共生有能够降解杀虫剂的菌群，昆虫即可以对杀虫剂产生抗性，并降解杀虫剂，而且通过宿主昆虫与肠道细菌的免疫互作，也能使宿主对生物农药的抗性提高。通过对该机制的研究呢，也有利于对昆虫的生物防治。
4结束语
昆虫肠道内含有数以万计的微生物，含有丰富的微生物资源。昆虫为肠道微生物提供一个相对特殊且较外界环境稳定的生境，于此同时，昆虫肠道微生物为昆虫提供营养物质、协助免疫系统，为昆虫的发育和代谢作出贡献。
现已有关于昆虫肠道微生物多样性方面的研究报告，也见少量从家蚕、白蚁、蟑螂等少数昆虫肠道进行微生物菌株分离的报道，如从蟑螂肠道中分离获得产抗菌蛋白的假单胞菌，从螳螂肠道中分离获得产抗肿瘤活性分子的霉菌菌株。基于现今科学技术的发展及社会发展，昆虫肠道微生物的研究应着重于以下几个方面。首先是通过昆虫肠道菌群不断探索新的害虫防治方法。根据肠道微生物的研究结果，可以有效进行害虫的生物防治。此外，目前人们已经对许多昆虫的肠道微生物种类进行了研究，但对很多肠道微生物的作用和功能并不太了解，尤其是人们对肠道微生物彼此的复杂关系、其在昆虫生理、发育中所起的具体作用、以及相应的机制尚知之甚少，因此应致力于研究、理解其互作关系的机制，并投之于研制、应用微生态制剂。同数十万计的昆虫种类相比，目前关于昆虫肠道微生物资源的发掘和利用，只能算是刚刚起步，有大量的昆虫种类还有挖掘具微生物资源的价值，肠道微生物有更多我们未知的功能需要被继续研究利用。
参考文献
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[2]夏晓峰.小菜蛾中肠微生物多样性及其功能研究[D].福建农林大学，2014.
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微生物学研究方法篇4
1氧化亚铁硫杆菌的生理特性
氧化亚铁硫杆菌(thiobacillusferrooxidans):是生物湿法冶金过程主要的浸矿菌种。这种菌系短杆菌,很小,0.3～0.5×1.0-2.0um,圆钝末端,以单个、双个或几个成短链状存在。是一种化能自养菌,专性好氧,嗜酸性,广泛生活在金属硫化矿和煤矿的酸性矿坑水中。最适生长温度25℃～30℃。生长在pH1.4～6.0之间,最适pH2.0～2.5。t.f以氧化亚铁、元素硫以及还原态的硫化合物等来获得生命过程所需的能量,以空气中的二氧化碳为碳源,以氨或铵盐为氮源。有鞭毛,能快速游动,革兰氏染色阴性。在9K固体培养基上呈红棕色菌落,近杆形[5]。
2氧化亚铁硫杆菌的氧化机理
自20世纪60年代以来,因为它们具有特殊的生物学功能,吸引了许多学者对t.f和t.t的生理特性进行了研究。许多研究表明,t.t利用单质硫的能力比t.f强,但t.t不能利用硫酸亚铁。wong和Henry对氧化硫酸亚铁的机理进行了详细的研究,指出能将亚铁氧化成三价铁,三价铁会与硫酸根离子发生反应产生铁矾沉淀,同时产生硫酸而引起pH的下降:
4FeSo4+02+2H2So42Fe2(So4)3+2H2o
(1)
6Fe3++4So42-+12H2o2HFe3(So4)2(oH)6+10H+(2)
templellvl和Leathen等人研究发现氧化亚铁硫杆菌能将矿物中的硫化矿物氧化为硫酸和硫酸盐。Bryne等对t.f氧化硫化矿物的机制进行了详细的研究。并提出了一些常见矿物的主要反应机理,如黄铁矿和黄铜矿:
2FeS2+702+2H202FeSo4+2H2So4
(3)
4FeSo4+02+2H2So42Fe2(So4)3+2H20
(4)
CuFeS2+402CuS04+FeSo4(5)
2Cu2S+02+2H2So42CuS+2CuSo4+2H20
(6)
CuS+202CuS04(7)
3微生物分子生态学研究的一般方法和原理
微生物分子生态学是分子生态学的重要组成部分,是分子生物学、微生物生态学、微生物生理学与遗传学相互结合而产生的一门边缘学科。从目前的发展状况来看,当前的主要研究领域有:采用分子生物学技术研究不同自然环境中微生物的种类组成和群落结构以及它们的数量动态；环境因子对微生物基因表达的影响:自然条件下微生物之间遗传物质的转移:微生物与高等生物相互作用的分子机制,包括共生关系的建立、病原微生物的致病机制等。因此,微生物分子生态学是利用现代分子生物学的基础理论与技术,在分子水平上,研究微生物与其生态环境间相互关系的一门新兴学科。
3.1一般研究方法
(1)平板涂布分离。
(2)显微镜观察:普通光镜、相差显微镜、透射电镜、扫描电镜。
(3)mpn法,即最大或然值计数法,是平板涂布分离法的一种,但由于广泛应用,被单独作为微生物研究的一种技术。
(4)活菌计数法,常见的用哑咙橙染色,活菌死菌颜色不一样。
3.2分子研究方法
(1)纯种分离,G+C测定、16SrDna,iSR测序、比对。
(2)变性梯度凝胶电泳(DGGe),通用引物pCR扩增同样长度的基因,常为16S的一段(300bp～400bp),割胶纯化、克隆测序,比对变性梯度凝胶电泳((DGGe)技术以土壤微生物群体的基因组Dna为研究对象,通过比较不同土壤中各种微生物的16SrRna基因信息来了解微生物的多样性。
(3)FiSH荧光原位杂交,设计不同荧光染料标记的特异探针,检测不同分类界元水平的细菌,可在细胞水平或者核酸水平与目标菌种杂交,在表面荧光显微镜或者CLSm(共聚焦激光扫描显微镜)下监测。
(4)tRFLp,末端限制性长度多态性。
(5)aRDRea.RiSa。
(6)流式细胞仪计数。
(7)Real-time实时荧光定量pCR监测技术。
(8)克隆转化法:通用引物扩增从水样、土样中提取得总Dna,获得全长的16SrDna序列,随机克隆入载体,转化到大肠杆菌,挑取阳性菌落,用不同的限制酶酶切检测不同的克隆,测序、比对。
(9)Dna芯片技术,主要用来研究微生物的功能基因组学。
4本论文的立论依据
amD的pH通常很低,严重的地方可达pH2.0,富含So42-离子和Fe3+离子,易浸出废矿石中的有毒元素,如铅、砷、铬、铜等以及氰化物,对矿业生产、生态环境造成严重危害,所以就amD的研究越来越重要。我国自1959年以来,对微生物处理污水的技术的研究已取得了一定的成果,但重点放在污水菌种的保藏的研究方面,而且就整体情况而言与国外相比要差的远,在污水处理微生物生物学方面的研究相对于前者明显滞后。不仅设备、工艺落后,更主要的是对微生物本身没有作进一步的研究,缺乏对菌种生物学性状较为全面的认识,譬如菌种的生理、生化性状以及分类地位的了解,缺乏对菌种分子水平上的认识及其在污水处理过程中菌种所参与的机理等的研究,因而也就不能很好的指导生产实践。从目前发表的一些较为零碎的文献及几本专著看出,在酸性污水中细菌的研究方面,生物领域的科技工作非常薄弱,主要是一些污水治理方面的专业人员在从事相关研究。
目前,我国对浸矿细菌的资源开发工作做的远远不够,根据国内外文献报道,用于处理酸性污水的细菌有氧化硫硫杆菌(a.thiooxidans)和氧化亚铁硫杆菌((acidithiobacillusferrooxidans);钩端螺菌(Leptospirillum)、中等嗜高温菌,如文献报道的硫化杆菌属(Sulfobacillus),如热氧化硫化杆菌(Sulfobacillusthermosuidooxidan)以及一些未确定分类位置的细菌、嗜酸嗜高温古细菌等。就细菌遗传多样性、系统学研究工作来说,目前国内发表的文献主要集中在放线菌、根瘤菌、嗜盐碱的古菌方面,对硫杆菌其他浸矿细菌的多样性及系统发育工作而言,国内尚见较为系统的报道。因此,对硫杆菌及其它浸矿细菌的多样性研究就很有必要。
(1)硫杆菌(thiobacillus)及其它嗜酸菌分子系统学研究目标及意义。
在地球表面广泛分布有元素硫及其金属化合物而形成的许多特殊环境,如硫铁矿、地表及海底的含硫热泉等。近年来,由于各国微生物学家对极端环境条件中的微生物资源的研究开发成为一个热点,使得硫铁矿、含硫热泉等酸性条件中的微生物多样性的研究取得了较快的进展,发现了许多生理生化性状特殊的细菌,其中有些归属于硫杆菌,有些目前还未确定其系统位置。分子生物学技术在含硫的酸性环境微生物系统学、生态学研究中的广泛应用,不仅发现了许多常规技术不能发现的新细菌,也对这些细菌的分类及系统学地位的确定提供了有力的手段,同时对一些已知细菌的分类及系统位置进行了修订,使得传统意义上的硫杆菌分类更趋合理,尽量可以建立一个亚利士多德所谓的接近于自然的分类体系。对氧化亚铁硫杆菌系统学地位的确定不仅具有重要的理论意义,对指导细菌浸矿等生产实践中优良菌株的选择也具有直接的应用价值。我国地域广阔,各种含硫的矿产资源及自然生态环境非常多样化,蕴含着非常丰富的代谢硫的细菌资源,而倍受国外微生物学家的关注,因此加大这些细菌资源的开发和研究力度,将为这些细菌的生产应用实践奠定理论基础。本课题研究的目标之一就是大量开发我国不同酸矿环境中的微生物资源,尤其是一些硫氧化细菌及其这些细菌的分子系统学的研究。
(2)不同环境中嗜酸菌的遗传多样性研究及其意义。
由于acidithiobacillusferrooxidans,a.thiooxidans,a.caldus,Leptospirillumferrooxidans这几种细菌能够氧化亚铁、还原性的金属硫化矿,目前被广泛应用于微生物湿法冶金、煤和天然气脱硫、酸性矿区的生态恢复治理、污水处理等技术,使得这些细菌成为微生物学家研究的热点之一。但是由于硫矿的化学组成不同与含硫酸性环境在地球上的生态分布与多样性极其复杂,使得这类细菌同一种不同菌株的生理生化性状表现出显著的不同,形成了表型差异明显不同的菌株,同时造成这些细菌不同菌株的遗传组成差异显著,即所谓的遗传多样性,利用分子生物学技术研究这些细菌的遗传差异,不仅有助于筛选、鉴定出性状明显不同、在浸矿实践中针对不同化学组成的矿体表现高效的菌株,反过来也可以从物种进化上阐明不同环境造成的选择压对细菌进化的作用以及细菌对环境的适应性,进一步对表型差异悬殊、介于相似种之间的菌株的系统学地位重新进行研究修订,并且有助于阐明自然界广泛分布的许多代谢硫、铁有关的细菌的起源及进化关系。目前,虽然微生物冶金基础研究被列为国家973重点基础发展计划,但我国在浸矿细菌的生物学基础研究方面所作的工作几为空白,对这些细菌的多样性有待进一步研究挖掘。从世界各地大量采集分离纯化菌株,进一步阐明这些细菌的分子系统学及进化关系,从遗传多样性的角度选择优良菌株,为应用于生产实践提供理论基础。
由于我国生态环境多样性非常丰富,存在各种各样的富含金属及硫化合物的生态环境,因此有可能分离到生理及遗传差异明显的不同菌种,存在非常丰富的种以上水平和种下水平的多样性。但到目前为止,国内对嗜酸细菌物种多样性和遗传多样性的研究几乎为空白,基于此这两个细菌多样性的研究是本课题的主要目标之一。
5前景展望
在研究的基础上,进行微生物优势群落的生理生化分析和限制多态性分析,可继续进行矿区酸性污水微生物类群多样性的研究,进而研究矿区酸性污水微生物类群的结构和分布的特异性,进而确定这些菌株分类学和系统发育学地位。由于条件有限,本研究许多方法、步骤还有待改进和完善(比如在提取污泥中细菌的方法上我们有待改进),在未分离和测序的种群中,还蕴藏着丰富的微生物资源,需要进行进一步的研究。随着工业污水微生物资源研究理论的发展和研究技术的完善,人们必定从工业污水微生物中获得瞩目成果,更好地为人们的生产生活服务。
参考文献
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微生物学研究方法篇5
关键词微生物；环境保护；作用原理；发展前景
中图分类号Q939.99；X505文献标识码a文章编号1007-5739（2017）12-0177-02
abstractmodernmicrobialtechnologyplaysacrucialroleinenvironmentalmicrobialdetectionandgovernance.inthispaper，theapplicationofmicroorganisminthefieldsofairpollutioncontrol，industrialwastewatertreatment，pesticideresiduescontrolandenvironmentalpurificationwaselaborated，itsactionprincipleanddevelopmentprospectsinenvironmentalprotectionwereexpounded，soastoprovidereferencesforapplicationanddevelopmentofmicroorganisminenvironmentalprotection.
Keywordsmicroorganism；environmentalprotection；actionprinciple；developmentprospects
微生物是指个体难以或无法用肉眼观察的一切微小生物的总称，包括细菌、病毒、真菌、少数藻类以及一些小型的原生生物[1]。微生物个体微小、种类繁多，涵盖了众多有益和有害的生物种类，由于其体积微小、体表面积大、吸收多、转化快、自身生长繁殖迅速，已经被广泛应用于食品安全、医药医学、工农业、环境保护等诸多领域[2]。
由于现代科学技术发展迅猛，人民生活水平快速提高，各个领域间的技术发展也是飞奔猛进，人们在生产、生活中对化工产品的需求量越来越大，但是随之而来的环境问题却一直困扰着人们。
目前，我国的环境保护工作进入“以环境优化促进经济增长”[3]的阶段，而利用微生物进行环境治理是便捷、高效、无污染的措施。随着科学技术的发展，微生物技术的优势已经越来越明显，利用微生物进行环境治理已经不断深入和完善。实践表明，微生物技术将成为环境保护的重要手段。各国都在大力研发微生物技术，今后微生物技术在环境保护领域中将占据更高的市场。
1微生物在大气污染治理中的应用
随着工业的迅速发展，人口激增，进而带来的是一系列的大气污染问题，从而引起各种危害，如臭氧层被破坏、酸雨发生越发频繁、温室效应等。F主要从4个方面介绍微生物在大气污染治理中的应用，包括nox的微生物净化技术、微生物烟气脱硫技术、微生物除臭技术、二氧化碳的微生物固定技术[4]。
1.1nox的微生物净化技术
nox的微生物净化技术原理是利用脱氮菌在外加氮源的环境下，将大气中有害气体nox还原成无害气体n2，在进行还原的同时，脱氮菌利用nox作为氮源营养物质进行自身增殖，如此循环还原，从而达到多次净化的作用[5]。爱德荷国家工程的实验室研究人员利用脱氮菌进行脱氮，已经将氮净化率提高到99%[6]。该方法能有效去除废气中的nox，因其工艺流程简单、能源消耗低、净化效率高、无二次污染、能进行循环利用等优点，可以推广用于其他工业有害气体的治理，从而达到有害气体的再利用。现在，各国的科学家正在研究将nox的微生物净化技术与细胞固定化技术相结合，从而寻找对有害气体nox进行净化的更便捷、易操作的方法。
1.2微生物烟气脱硫技术
现阶段，对烟气中的Sox、H2S的治理有2个方法：一种方法是利用化学反应原理，将Sox、H2S转变成H2So4；另一种方法便是利用氧化亚铁硫杆菌的特性，吸收大气污染中的Sox，同时利用吸收液中的微生物使Fe2+和Fe3+进行相互转化。由于Fe3+具有较强的氧化性，是良好的氧化剂，所以Fe3+的浓度越高，氧化性越强，脱硫的速度也就越快[7]。同时，反应生成的Fe2+又可以作为氧化亚铁硫杆菌的营养源物质，转化成产物Fe3+，再次加快So2的消化、吸收。研究表明，现在的氧化亚铁硫杆菌的脱硫率已经达到95%以上[8]，并且脱硫技术可以运用于煤炭中硫的去除、工业硫化氢气体的净化。
1.3微生物除臭技术
由于工业气体污染包含多种污染成分，其中还夹杂着部分固体颗粒，产生臭气，故科学家研究出微生物除臭技术，用于处理工业污染引起的臭气。微生物除臭技术[9]是先将臭气溶于水中，然后运用微生物的体表面积大、细胞膜和细胞壁可以吸附溶于水中的臭气的特性，将臭气分解为可溶性物质，使工业污染中的臭气被消除；同时，微生物利用臭气中的成分作为自己的营养物质，进行自身的生长繁殖，增加了微生物的数量，加快除臭环节的进行。此技术净化效率高、成本低，是可以推行的工业除臭技术。德国、荷兰等国家已经开发了生物臭气处理装置，除臭效率可达1万～15万m3/h[10]。
1.4二氧化碳的微生物固定技术
二氧化碳污染是最常见的气体污染，可利用物理、化学技术进行去除，但微生物的各种条件更为优越，能在进行污染物治理的同时实现自身的生长繁殖，故使用微生物进行碳的固定，产生许多有利的物质，如有机酸、多糖、维生素、氨基酸等。常见的固碳微生物有螺旋藻、小球藻、真养产碱杆菌等进行固定作用，分解二氧化碳[11]。
2微生物在工业废水处理中的应用
微生物对工业废水进行处理的方法是利用其生化反应，通过酶催化对工业废水起到转移和转化作用，从而使工业废水得到净化、循环利用。微生物技术处理工业废水主要是进行有机物的降解、重金属离子的处理及其他物质的除杂。
2.1废水中有机物的降解
微生物降解污水中的有机物是利用微生物的新陈代谢过程中需要进行物质间的吸收利用，产生容易分解的代谢物，周而复始，使污水中的有机物被分解完全[12]。
20世纪70年代微生物絮凝剂已经问世，其来源为微生物，来源广泛，安全性高，是自然的新型水处理剂[13]，现已经应用于高浓度、难治理的农药废水中。高效微生物的研究应用是解决农药废水实现高效、快捷处理的关键[14]，可以利用em菌、小球绿藻、芽孢杆菌等对农药残留的有机磷、硫等物质进行消化吸收。经过科学家们的研究，降解率已经从72.3%[15]升高至99.7%[16]，同时，中国科学院与中国科学院武汉病毒研究所从污泥中分离出假单细胞，其在18h内能将1000mg/L甲胺磷降解75%左右[17]。
2.2含重金属离子的处理
微生物治理重金属离子主要是靠真菌，由于真菌生长速度快、菌丝绵长、附着力强，利用静电吸附作用和霉菌体内的催化转化作用及络合作用，使重金属被吸附消化[18]，而且微生物的代谢产物可以自行分解，具有成本低、效率高的优势。近年来有研究表明，已经利用微生物从废水中分离、净化、回收铜、汞、铬等重金属，多次净化率高达99.9%[19]。
另外，1998年Kuhn[20]利用海藻酸钠固定生支动胶菌除去溶液中95.9%的Cd2+。至此，科学家开始利用各种生物技术与现代科技技术相互结合，除去了废水中99%的重金属离子，实现了废水再利用，达到了净化水质的效果。
2.3废水中其他物质的去除
废水中除了有机杂质、重金属外，还有其他有色颗粒存在。目前，对有色废水的处理是采用微生物絮凝剂进行脱色，该处理剂是利用生物分解性，将细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而成。研究表明，它克服了无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，现在已经研发了微生物絮凝剂noC-1对发酵后的有色废水、造纸碱性黑液等进行脱色，发现其脱色效果显著，可使废水变为清澈、透明[21]。
3微生物在环境净化中的应用
19世纪末，经济日益增长，环境问题越发严重，随着微生物治理方法的出现，标志着人类利用微生物进行环境保护的工程开始，经过上百年的研究，微生物已经在治理环境中被广泛应用。
3.1废弃物的降解、转化
微生物由于代谢类型的多样化，几乎能降解环境中的各种天然物质，尤其是有机化合物。现在国内外已经普遍采用微生物技术降解转化石油、农药、重金属、多氯联苯（pCB）等未能被利用的污染物。大量研究发现，采用红色诺卡氏菌与酿酒酵母结合，能够完全降解毒性极其稳定的多氯联苯[23]。日本环境科学与民间企业共同研究发现一种可以分解pCB的微生物，分解率可达64.5%[24]。中国科学院微生物研究所筛选出高效降解RDX的棒状杆菌、降解tnt的芽孢杆菌，其降解率高达90%以上。故微生物是现代工业发展的坚强后盾。
3.2环境监控
微生物无处不在，现在已经利用微生物的特性进行环境监控：用粪便污染指示菌（大肠杆菌、克雷伯氏菌）检测水质[25]；用鼠伤寒沙门氏菌检验物质的突变性及致癌性[26]；用荧光细菌的灵敏性快速检测环境中的毒物[27]。
3.3固体废物堆肥处理
固体废物中水分充足，营养物质充分，有大量的微生物群存在，在一定温度下，只要有适宜的条件，微生物便会大量繁殖，并进行生物分解，从而引发堆肥发酵，发酵后的堆肥可以为作物提供生长所需的养分。最近研究发现，白腐真菌对含苯的有毒物质具有很强的耐受、降解能力，有利于进行堆肥的处理[27]。
3.4活性污垢处理废水
活性污垢是指经过人工培养，含有有机物和细菌的污水，经过微生物的不断生长代谢，产生絮状、有很强吸附能力的微生物团。活性污垢适用于工业废水、造纸、合成纤维废水等的处理，可实现废水净化与循环利用，从而提高物质的再利用率[28]。
4微生物在其他污染治理中的应用
微生物除了应用于大气、废水的污染治理外，还可以应用于其他方面的治理，例如生活垃圾、农药、土壤等处理。生活垃圾主要是白色污染，这需要运用微生物的分解原理，对塑料袋进行分解；农药残留主要是多余的有机磷、硫，引起藻类的疯狂增长，而导致赤潮、蓝藻水华等危害，近年发现可以利用em菌抑制蓝藻的生长，同时控制水中氮的含量；土壤中微生物的利用方面，主要是利用根瘤菌起到固氮的作用，将空气中的氮转化为植物光合作用所需的物质，从而进行生命的正常活动；后期，开始利用嗜热及嗜温细菌、硝化细菌、蛋白及果胶水解微生物、固氮微生物和纤维素分解微生物对固体废物进行堆肥处理，让微生物快速分解并进行自身的生长，从而提高土壤肥力，利于作物生长[22]。
5微生物在环境保护中的发展趋势
随着科学的发展，人类越来越重视环境保护，微生物环境保护的作用越来越重要，其体现的经济效益、环境效益引发企业、科学界的关注。微生物在环境保护中的发展呈现以下发展趋势。
5.1综合利用
为使物质资源得到充分利用并减少能源消耗，微生物污染治理趋向综合利用。根据各微生物的固有特性，如微生物菌体、微生物体内酶等将生活垃圾、固体废弃物制成沼气池发电，产生能源供人类使用。当前的微生物技术已经日趋成熟，由于其经济高、投资少、重利用率高的优点，已经成为各个发达国家青睐的城市垃圾处理途径。目前，世界各国有200多座垃圾沼气田处于运营阶段，不仅收获了电力资源，还获取了肥力资源。
5.2从治理到预防
早期工农业因追求经济效益而忽略环境治理，现在世界各国已经高度重视环境保护，正在研发各种环境保护技术措施，同时时刻关注重要的世界性环境问题，采取相应的方法防患于未然。微生物环保技术是首选的环境治理方案。现阶段各国正在研发微生物农药用以代替化学农药，从而减少化学农药带来的污染，如分解快、毒性低的微生物杀虫剂等。
5.3完善微生物环境保护技术
目前，对微生物技术的研究都应放在基础研究与应用相结合上，大规模推广微生物技术，构建生物反应器，优化运行条件，研究新方法，高效地进行环境保护与污染治理。
5.4开发微生物资源
微生物具有种类繁多、资源丰富、繁殖快、生存条件要求低的特点，根据现阶段国际社会对微生物的重视情况，各国应该继续开发微生物资源，使其应用于更多的领域。继续寻找新物种，如耐热性菌、抗耐性强的菌种、在特殊环境下仍可以生存的菌落，使之更多地用在环境保护上。同时，由于微生物结构简单，可以从分子水平对微生物进行深入研究，运用基因工程及生物技术，让微生物技术更好地服务于人类[29]。
6结语
综上所述，微生物在环境治理过程中起着重要的作用，应该对微生物进行更深入的研究，将其可利用率提高到最大化。目前，我国的微生物应用已经取得很大的成功，然而进一步的研究仍需要科技、经济的持续投入。大力开展以微生物技术为主体的环境保护技术研究，将推进微生物技术在环境保护中的应用，通过微生物技术的不断发展，满足国内需求，并占领国外市场。
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微生物学研究方法篇6
【关键词】肝代谢;微粒体,肝;肝细胞;药代动力学
0引言
肝脏是药物主要的和重要的代谢器官,是药物生物转化的主要场所,是富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素p450的混合功能氧化酶系统,大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的,因此药物的体外代谢模型主要是以肝脏为基础的,并以其特有的优势和特点在药物代谢的研究中得到广泛的应用.体外药物的肝代谢研究已经发展很长时间,与体内代谢研究相比,体外代谢研究有许多优点,①体外代谢研究可以排除体内诸多的干扰因素,直接观察到代谢酶对底物的选择性代谢,为体内代谢研究提供重要的线索和依据.②对于体内代谢转化率低且缺乏灵敏检测手段的药物来说,体外代谢不失为一种很好的研究手段.③体外代谢研究具有快速简便的特点,适合大量化合物的药动学筛选.④不需要消耗大量的样品和实验动物,因而研究费用相对较低[1].我们从体外肝代谢模型入手,综述了近年来药物体外肝代谢的文献.
1肝微粒体体外温孵法
肝微粒体体外温孵实验是采用从肝脏中提取的肝微粒体,并加入还原型辅酶ii(naDpH)再生系统,在体外模拟生理环境下进行代谢反应,采用高效液相色谱(HpLC)、高效液相色谱质谱联用法(HpLCmS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法.
1.1Ⅰ相代谢Ⅰ相代谢又称为官能团反应,包括氧化、还原、水解、水合等反应.naDpH为还原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,是许多药物生物转化反应中不可缺少的辅助因子,它在这些反应中起到还原剂的作用,体系中只要naDpH浓度达到1mmol/L时,便足以维持药物代谢反应进行,但naDpH价格较高,且不易长时间保存.因此常采用naDpH再生系统来代替naDpH.即利用相对稳定和廉价的辅酶ii(naDp)与6磷酸葡萄糖在6磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下生成naDpH.
6磷酸葡萄糖+naDp6磷酸葡萄糖脱氢酶
6-磷酸葡萄糖内脂+naDpH
文献[2]研究了吡喹酮在大鼠肝微粒体内的代谢情况,发现在不同诱导剂对大鼠肝微粒体诱导后其羟基化代谢产物不同.姚庆强等[3]则利用大鼠肝微粒体温孵实验对黄皮酰胺的正反异构体的代谢情况进行了考察,并采用HpLCmS对其代谢产物进行定性和定量,发现右旋和左旋的黄皮酰胺均代谢产生3去氢黄皮酰胺.姜敏等[4]应用CYp3a特异性诱导剂地塞米松、CYp2B诱导剂苯巴比妥、CYp1a诱导剂β-萘黄酮分别对wister大鼠进行在体诱导,建立肝微粒体温孵及naDpH再生体系,HpLC紫外检测法测定.研究结果提示甲基莲心碱具有酶促动力学代谢特性;CYp3a及CYp2B是介导甲基莲心碱在大鼠体内生物转化的CYp450亚酶,其中主要参与甲基莲心碱代谢的为CYp3a.王汝涛等[5]研究了染料木黄酮在大鼠肝微粒体代谢的酶动力学,研究发现CYp1a2参与了染料木黄酮的代谢,CYp1a2的抑制剂可能会与染料木黄酮发生代谢相互作用,从而降低染料木黄酮的代谢速率.曹露晔等[6]研究了蓝萼甲素在大鼠体内外的代谢转化,发现蓝萼甲素在大鼠肝微粒体和胆汁中可被代谢转化,主要代谢产物为羟基化蓝萼甲素.Sung等[7]研究了KR60436(一种钠钾atp酶抑制剂)在大鼠和人肝微粒体中的代谢情况,发现在两种微粒体中KR60436可产生7种氧化代谢产物,其中4种为氧化代谢产物.anne等[8]采用大鼠和人肝微粒体孵育体系,对rhazinilam进行体外孵育,发现其在大鼠肝微粒体中可被氧化为3种代谢产物,并确定CYp2B6为主要的药物代谢酶.
1.2Ⅱ相代谢Ⅱ相代谢又称结合反应,包括糖苷结合、硫酸化、甲基化、乙酰化等反应.一般认为Ⅰ相反应使药物产生或去掉一个基团,从而使Ⅱ相反应得以发生.因此Ⅱ相反应是真正的解毒途径,它大部分生成药物的非活性形式而排除体外.目前采用肝微粒体体外孵育反应主要集中在药物的葡醛酸化反应,通过肝微粒体与UDpGa孵育得到该药物的葡醛酸化结合物,并考察其酶动力学.
栾连军等[9]用高效液相色谱法分离测定大鼠肝微粒体中普萘洛尔葡醛酸化代谢产物,通过体外孵育得到外消旋普萘洛尔两种对映体的葡醛酸化代谢产物.采用不同诱导剂对大鼠肝微粒体诱导后,采用体外孵育的方法,对氧氟沙星对映体葡醛酸化代谢进行研究,结果表明不同诱导剂诱导的大鼠肝微粒体对氧氟沙星对映体代谢有明显的影响.裘雅渔等[10]对大鼠肝微粒体体系中银杏萜内酯代谢进行考察,通过HpLCeLSD对银杏萜内酯剩余量的测定,考察其酶动力学,结果表明,银杏萜内酯在该体系下代谢较慢.Sabine等[11]对几种短链的脂肪醇葡醛酸化代谢进行研究,采用人肝微粒体孵育体系,并采用GCmS进行测定,同时测定其酶动力学.结果发现,对于短链脂肪醇来说,不止一种Ⅱ相代谢酶催化其代谢反应.Rangaraj等[12]研究了氟派啶醇在大鼠肝微粒体的葡醛酸化反应,并采用HpLC/mS/mS测定.结果表明,Ⅱ相代谢酶UGt2B12,UGt2B1为该药物的主要催化酶.
2肝细胞体外温孵法
肝细胞体外孵育法与肝微粒体法相似,即以制备的肝细胞辅以氧化还原辅酶,在模拟生理环境条件下进行代谢反应的体系.培养体系中的肝细胞可以很好地模拟体内肝脏的生理环境,在研究外源性化合物的生物活性、毒性、毒理机制、代谢命运和致癌性检测等方面有许多优势,被认为是药物临床前毒性检测的可靠模型[13].Born等[14]利用新鲜分离的鼠肝细胞检测了香豆素的代谢产物,发现香豆素经肝细胞代谢产生的香豆素环氧化物和该环氧化物的代谢产物0羟苯乙醛是引起肝毒性的主要原因.Yoshihiro等[15]利用新鲜分离的肝细胞考察了十几种化合物的体外清除率,并与体内血浆清除率比较,发现两种方法一致性较好,在药物研发中有很好的应用前景.曹国颖等[16]考察了那格列奈在大鼠游离肝细胞中的代谢特点,结果表明CYp450同工酶CYp2D6和CYp2C9在那格列奈羟基化过程中起重要作用.
3肝匀浆体外温孵法
上述采用的体外肝代谢都比较复杂,操作比较烦琐,因此目前很多研究人员为了简化实验,直接采用将肝脏匀浆的办法,将药物加入到肝匀浆溶液中,考察其在肝匀浆液的代谢情况来说明药物在肝脏中的代谢情况.陈聪颖等[17]将槐苷在大鼠肝匀浆液中孵育,采用RpHpLC法测定槐苷及其代谢产物.研究表明,其主要代谢产物为苷元.李文兰等[18]研究了邻苯二甲酸丁基苄酯在不同性别小鼠肝匀浆中的生物降解.结果表明,邻苯二甲酸丁基苄酯在肝脏中代谢有明显的性别差异.陈怀侠等[19]采用液相色谱-串联质谱法分析大鼠山莨菪碱肝匀浆代谢物.结果在大鼠肝匀浆培养液中发现了脱水山莨菪碱,说明山莨菪碱在大鼠肝脏中可以被代谢.吕承等[20]将灯盏乙素与的家兔小肠内容物、肝组织匀浆和血浆在37℃孵育.结果表明灯盏乙素体外不稳定,在生物样品中降解迅速,肝脏、血液、小肠等都是灯盏乙素可能的降解部位.林文辉等[21]研究了布洛芬离体肝代谢中对映体间的相互作用,发现在手性转化代谢过程中存在对映体的相互作用,即S(+)-布洛芬可以抑制R(-)-布洛芬的转化.
4结语
综上所述,常用的体外肝代谢研究方法有肝微粒体体外孵育法、肝细胞体外孵育法及肝匀浆体外孵育法.这三种方法各有利弊,其中肝微粒体体外孵育法在体外肝代谢研究中应用最为广泛.该方法与其他体外肝代谢相比,具有酶制备技术简单、代谢过程快、结果重现性好、易于大批量操作等优点,但该法所得的结果与体内代谢的一致性方面存在不足,需要体内代谢结果的验证.而肝细胞体外孵育法主要应用在药物的体外代谢清除率方面,但肝细
胞制备技术比较复杂,同时制备好的肝细胞在体外的活性只能维持4h,不利于储存和反复使用.肝匀浆体外孵育法是一种最简单的体外肝代谢孵育方法,具有制备简单、实验时间短等优点,但由于在肝匀浆液中各种酶比较复杂,因此对于样品处理及测定方法来说干扰比较大,而且肝匀浆液很容易失活,这也是其应用不太广泛的原因之一.除了上述三种主要体外肝代谢方法外,还有肝组织切片法,该方法的优点在于可以保留所有的肝药酶及细胞器的活性,对于某些药物代谢研究来说,有时采用肝组织切片技术比肝微粒体孵育更好.但由于该技术需要切片机等特殊的设备,因此近年来已经很少被采用.
总之,药物的体外肝代谢作为考察药物代谢的技术之一,随着时间的推移在今后会越来越受到人们的重视,必将成为药物代谢领域里必不可少的组成部分.
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微生物学研究方法篇7
关键词：宠物；微生物；传染病；共患病
中图分类号：S855；S82文献标识码：B文章编号：1007-273X（2017）02-0008-02
随着城镇化的进展和人们生活节奏的加快，人类物质生活条件越来越好，但是由于闲暇时间的减少、居住模式的变化、网络的影响，人们相互陪伴的时间减少，精神变得愈加空虚，为消除孤寂或出于娱乐而豢养宠物的数量随之快速上升。以往的宠物一般是犬、猫等哺乳类动物或者鸟类，易喂养也容易与人互动。现在除了哺乳类、鸟类，还有爬行类、两栖类、鱼类、昆虫类和节肢类等。宠物体内含有大量的微生物。稳定的微生物生态系统对宠物的健康成长意义重大。当体内微生物系统平衡被打破或者病原微生物入侵时，宠物的机体便遭受破坏。同时，当人们与宠物发生肢体接触时，宠物体内携带的致病微生物可进入人体内，且与人类致病菌发生组合和变异的机会也相应增多。狂犬病、流行性出血热、弓形虫病、口蹄疫等都与宠物有关。而近年来因为抗生素的广泛使用，使得致病微生物的耐药性增强，病菌、病毒的基因突变加快，各种耐药致病微生物不断出现。目前使用的多数抗生素，已对人类和动物身上携带的致病微生物不起作用了。
1胃肠道微生物
宠物胃肠道微生物对宠物机体的影响最为重要，是宠物体内微生物研究中最为热门的研究方向。宠物体内胃肠道系统中存在数量巨大的微生物群落，在宿主胃肠道内形成微生态系统。
1.1胃肠道微生物的作用
研究表明，消化道菌群、消化道环境与宿主三者之间相互影响、相互作用，共同参与食物代谢过程。这些微生物能有效帮助宠物避免感染，特别是胃肠道的感染，同时积极地与连接免疫细胞的黏膜相互作用[1]。另外，微生物菌群和宿主的共生可促进宠物的健康。因此，无菌宠物比具有完整胃肠道微生物群落的宠物更易感染疾病。随着对胃肠道微生物研究的深入，肠道微生物对宿主营养代谢或免疫调节的作用已逐渐被人们认识并接受。
1.2水生宠物胃肠道微生物
目前，高等宠物肠道微生物与宿主代谢、免疫的关系和调控机制已成为研究热点。然而对于水生宠物肠道微生物与宿主代谢、免疫的关系和调控机制的研究并不多。与陆生宠物相比，水生宠物处于更为复杂的生态环境之中，其肠道微生物结构更为多样、复杂。近几年，国内外有一些学者对水生宠物肠道微生物开展了研究。主要研究方向不仅包括检测样品中微生物的组成，还包括水生宠物肠道微生物在宿主代谢、免疫中的作用。研究最早采用微生物纯培养方法。但是纯培养的方法在研究环境微生物组成时往往存在培养条件复杂或环境细菌难以进行纯培养等问题。后来，分子生物学技术逐步被应用到水生宠物肠道微生物研究中，如变性梯度凝胶电泳、末端片段长度多态性等指纹图。这些方法成本较低，但研究者难以通过这些技术直接了解样品中微生物的组成信息。高通量测序技术可有效解决这一问题。
1.3胃肠道微生物研究方法的进展
胃肠道微生物被认为是药物、酶基因和其他新型产品的筛选来源。核酸分析表明，肠道中很大一部分微生物是无法体外培养的[2]，因此要想全面认识肠道微生物，就必须采用纯培养方法。
目前，对宠物胃肠道微生物研究方法应用最广也是最为基础的方法便是胃肠道微生物纯培养。但是纯培养方法受到多种因素限制，如培养基选择性、厌氧条件以及微生物相互作用等，导致至今通过纯培养方法可培养的微生物仍然只为哺乳类宠物胃肠道微生物群落的10%～20%[3]。
近年来，随着分子生物w的发展应用，分子微生态技术使胃肠道微生态学研究迅速发展，其中应用最为广泛的是16SrRna/Dna杂交和pCR技术[4]。但这一技术也存在局限，它无法探究宠物胃肠道中未培养微生物的遗传、代谢与生理免疫等情况。
2微生物类传染病
2.1常见宠物传染病
2.1.1猫抓病猫抓病是细菌性疾病，具有感染性，由巴尔通体菌属中的B.henselae感染所致的亚急性自限性传染病。如果被猫抓、舔或者咬伤皮肤后容易感染得病。猫、狗是该病的常见传染源，尤其幼猫更易传染。
2.1.2狂犬病狂犬病是由狂犬病毒引起的一种中枢神经系统急性传染病，又称恐水症。一般通过病兽齿咬而传染，如病犬病猫。目前没有有效的治疗，所以只能通过给宠物猫狗注射疫苗以降低传染。
2.1.3鼠咬热鼠咬热一般由家鼠咬伤引起，其次为猫、犬、猪等，病原体是小型螺旋菌或念珠状杆菌。治疗用红霉素，以防鼠为主。
2.2非常见宠物传染病
2.2.1兔热病兔热病由土拉伦斯杆菌引起，主要传染源是兔和鼠类。链霉素效果最好，也可以用庆大霉素、四环素、氯霉素治疗。同时做好在流行地区接种减毒活疫苗。
2.2.2马鼻疽马鼻疽是一种由马鼻疽假单胞杆菌引起的马、驴及骡的传染病，人因接触病畜感染，马是主要传染病，次之为山羊、猪和狗。因此，对患者要做好隔离治疗。预防首先隔离和处理病马，重视对该病的预防知识宣传。
3微生物类疾病的预防与控制
3.1抗微生物药品
抗微生物药品多年前便已投入临床兽医使用中。抗微生物药是指可抑制或杀灭病原微生物的药剂，主要适用于全身感染。抗微生物药包括抗生素、化学合成抗菌药、抗真菌药与抗病毒药。从1950年起，已有大量试验表明，抗微生物类药物具有免疫调节作用，能增强或减弱机体免疫功能[5]，但是抗微生物药品的不合理使用和滥用问题严重，常造成治疗失败、不良反应增多、药品浪费、细菌耐药性产生[6]、兽药残留[7]等问题。
对此，有研究表明药代动力学（pharmacokinetics，pK）和药效动力学（pharmacodynamics，pD）研究可以为抗微生物药品的合理应用提供依据。pK-pD可以描述药物对微生物产生效应的时间动力学过程及时间作用类型，对评价药物的有效性、推测最佳治疗剂量和用药间隔、不良反应最小化以及避免或减少药物耐药性都有指导性的作用。因此，pK-pD研究制定最佳临床给药方案具有重要的理论和实际意义[7]。pK-pD研究近年来才投入临床兽药应用中，较人药在此领域中的研究差距较大，需开展各种试验来获得相关数据，进而进行兽药给药方案的优化。
为减少兽用抗微生物药的使用对全球抗微生物药耐药性问题的影响需要采取一些有效措施，包括预警原则，例如禁止或限制给宠物使用一些对人至关重要的抗微生物药物。预防原则也是有效措施之一，如抗微生物药物使用前增加药敏感性试验、优先使用窄谱兽用抗微生物药、优化兽用微生物药物给药方案[8]。以上措施都是旨在消除宠物的病原微生物。但是耐药决定的主要来源不是病原微生物而是共生微生物。而且，目前给宠物使用的抗微生物药物作用和分布的低选择性会使宠物胃肠道的正常菌群受到影响。创新绿色抗微生物药是一类新型的兽用抗微生物药，对环境中的耐药因子几乎没有生态学影响是该类药物的显著特点[9]。新型创新绿色抗微生物药需同时具备药动学和药效学选择性。首先，要求该药物主要分布在靶向微生物所在位置。其次，需对使用该药的宠物的共生微生物和环境生态系统没有药效作用。
3.2共患病有效防控
迄今为止，新老重大共患病的流行因素依然存在，公共卫生突发事件时有发生，这与近百年来人类生产生活方式的巨大转变有着密切的联系但人医和兽医一体化公共卫生体系的缺位，某种程度上严重制约了新老共患病的有效防控。
传统思想的根深蒂固导致人医和兽医之间缺乏有效合作，协调不足。它们隶属于两个独立的行政主管部门，机构编制和人员设置的不同使它们难以进行有效的沟通和合作。这种情况也存在于人医和兽医的科研管理和科研活动当中。兽医应受重视，理由有三点：一是兽医对重大疫情先知先觉。二是兽医是重大疫情的第一道防火墙。多数重大动物疫情往往是从动物传播到人，只要遏制疫情在动物中的暴发和流行，就能及时为人类建立起第一道防火墙，阻止它向人类蔓延。三是兽医是重大疫病净化和消灭的关键。共患病净化工作的重点应着力于易感动物，同时做好易感染人群的隔离工作。一旦发现重大疫情在动物中的传播，应及时扑杀，并做好无害化处理。
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微生物学研究方法篇8
关键词：中职学校；实践教学；工学结合；任务型教学法
为了突出职业教育课程的逻辑核心“工作实践”，强化“以实践为导向，以服务为宗旨，以职业能力为本位，以职业实践为主线”的职教理念，实现培养目标与社会对人才需求的对接，提高教学的有效性。在“工学结合”理论的指导下我们以微生物课程为突破口，采用任务型教学、探究性教学等方法，对实践教学的有效性进行积极探讨，努力研究和实践，并开发出相关的教学资料，希望能为其他课程提供参考。
一、课题研究的提出与意义
“有效”是教学的本质特性，也是当前课程改革的核心思想，更是教育事业实现内涵发展的必然要求。然而，在当前学校教学实践中仍然存在教师教得辛苦、学生学得也不轻松的问题，因此，提高教学实践的有效性已经成为课程与教学改革的核心话题之一。如何认识“有效教学”的内涵，教师如何开展“有效教学”研究，如何判断教学的成效等都是理论和实践界普遍关注的问题，是改进课堂教学、培育优秀学生的需要，也是促进教师专业成长、提升教师专业水平、促进学校进一步发展的需要。
实践教学是学生巩固理论知识和学会运用理论知识解决问题的有效途径，是培养具有创新意识的高素质技术人员的重要环节，是理论联系实际、学习科学知识和提高动手能力的重要平台。而当前中职教育系统中实践教学的有效性研究却是一个比较薄弱的环节。因此，如何在中职学校开展实践教学有效性研究正是我们迫在眉睫需要解决的问题。基于此，我们提出了“中职学校微生物学实践教学的有效性研究”这一研究课题。
二、课题研究的背景
微生物课程是中职学校生物技术类、药物分析检验类、制药技术类等专业的一主干基础课，为专业课提供微生物方面的知识。为提高教学质量，许多学者进行了大量的研究和实践。经过查阅文献发现，如何提高微生物学实践教学质量，主要从教学内容、教学方法、考核评价方式、新教学理念运用等方面进行研究和探讨。
1.微生物学实验教学内容改革研究
实验实训课是微生物教学中重要的实践性教学环节，在内容和课时按适当比例分配的情况下，切实围绕教学大纲，力争做到“少而精”，突出重点，适当舍弃一些内容，使大多数学生能够举一反三，听得懂、记得住、用得上。柯乐芹等提出从学生的特点和专业以及将来主要从事的工作性质来选择实验内容、实验材料。广东省食品药品职业技术学校精简讲授内容，加强学生基础知识的掌握。黄秀玉通过加入新知识、新技术丰富教学内容，如在进行“细菌形态显微观察”时，向学生介绍新发现的直径达0.5mm的肉眼可见的细菌，使学生对“微生物是肉眼难见的，需借助显微镜观察的一大类生物的总称”这一传统观念有了一个新的认识，从而增强学生的使命感和学习的紧迫感。
2.微生物学实验教学方法改进研究
随着科学技术的不断进步，需要我们不断地提高教学理念和丰富教学手段。适当的教学方法不仅让老师教得轻松，而且能让学生学得高效。靖江卫校采用pBL+LBL双轨式教学模式，在教学中获得了理想的教学效果，该模式强调以问题为导向，提高了学生的主动性，培养了学生团结协作的精神和解决问题的能力。李燕琼等通过强调实验前的预习，要求学生积极参与到实验的教学中去，规范实验报告的写作，重视实验结果的分析等实验教学方法，提高学生的综合素质。
3.微生物学实验考核评价方式研究
评价的最终目的是全面考察学生的学习情况，调动学生的学习积极性，让学生全面掌握知识和技能。如何更好地对学生的学习进行评价。莆田卫校注重学生动手能力的培养，量化评分标准，严格考试制度，激发学生学习热情。评分内容有平时成绩50分，包括操作和结果40分，提问5分，纪律5分（迟到早退、旷课、环境整洁等），实验报告20分，期末考试30分（包括操作考试和口试）。还有一些老师制定合理的考核标准，提出最终只有实验成绩合格的学生才能参加最后的理论考试。实验总成绩=预习报告成绩+实验操作准确性+实验报告+期末实验考试成绩。
4.新教学理念在微生物学课程教学中的应用方面
针对职业教育改革的需要和相关行业对中职学生提出的新要求，在“行动导向教学”和“工作过程系统化教学”等新理念的指导下，许多中职学校在一些核心课程上做了不少研究和探索，取得了一定的成绩。在中国期刊网上输入“项目教学法或工学结合模式、中职、微生物教学”等关键词进行搜索查询，到目前为止关于项目教学法在中职学校微生物实践教学中的应用文献资料比较少。查到《浅谈项目教学法在〈食品微生物检验〉教学中的应用》《浅谈项目教学法在〈微生物学检验〉课堂教学中的应用》等。程新梅运用项目教学法课程教学，弥补传统教学方法在综合能力培养方面的不足。
以上关于中职微生物教学的研究从不同的角度探讨分析微生物教学的思路，侧重点不同，论述比较详细，有的文献梳理，有的微生物学教学存在问题的分析，也有贴近实践教学的例子，但未将实验教学内容、教学方法、考核评价方式和运用新的教学理念等方面进行系统的调查研究，更好地提高教学质量，基于此，我们希望通过本课题研究的开展，在一定程度上改善当前实践教学的有效性研究在中职教育系统中比较薄弱的状况，提高中职微生物学实践教学质量。
三、研究的主要内容
1.坚持贯彻“以典型工作任务引领知识技能”的原则，根据医药、食品、化妆品等行业的需求，邀请活跃在一线的“行业专家”，在“工作任务分析专家”和“课程专家”的组织引领下，对微生物学进行“工作任务分析”“职业能力分析”以及“课程分析”，从而确定微生物学的实践教学的内容和学生职业能力的培养目标。
2.运用任务型教学法、探究教学法等方法，改革创新微生物学实践教学设计，设计与编写各专业的微生物学实践教学大纲，编制具有专业特色的微生物学实践教学工作页。
3.进行学习情景设计，创新教学方法，并进行教学实践对比实验。
4.完善微生物学实践教学的学习评价方法并进行教学反思。
四、研究的主要对象
中职生自控能力较差，冲动性较强，对家长和教师往往表现出明显的逆反心理和行为，所以逃课、打架、斗殴现象时有发生。但是中职生在行为特点上有个明显的长项，就是喜欢实际操作，喜欢动手。虽然他们厌学文化理论课，但对于实践课、实验课以及其他需要实际操作的课程，往往兴趣浓厚。而这正是中职学校学生适应社会市场需求的必备条件。如何因势利导，进一步加强中职生实际操作技能的培养是中职课改的重要任务。
五、研究的主要过程
本课题主要运用观察法、调查法、文献法和实验法等方法，并参照工学结合一体化课程开发的过程，以微生物课程为突破口，经过了这样的工作途径：“行业情况分析职业能力分析课程分析确定学习目标确定学习内容典型工作任务分析开发工作页创设学习情景创新教学方法教学实践完善学习评价方法”。
1.微生物实践教学内容和学生职业能力培养目标的确定
工学结合课程的模式的中心是：让学生通过工作学会学习，学习的内容就是工作的内容。学生通过完成工作任务对所经历的过程和环境进行整体化感悟和反思，实现知识与技能、过程与方法、情感态度与价值观学习的统一。因此，本课题组首先通过了解学生，了解企业和进行课程分析，制定符合市场需要的实践教学内容和职业能力培养目标。
2.微生物课程教学资料（工作页）的编写与应用
为了进一步完善实践教学的设计和课程的设置，提高教学效果，本人尝试以教学工作页取代传统的实验报告。并拓展它的功能，使其学习与工作紧密结合，从而使教学内容更贴近企业生产实际。
工作页是一套全新的教学材料，能帮助学习者了解将来的工作，促进学习者的综合能力发展，为学习者的职业生涯打下坚实基础。因此，教学工作页的编写应结合专业的课程设置、专业就业方向和企业的需要来设计，编写时重点把握两个要素：学习者和学习内容即学习任务，并以学习情境（学习任务）为一个课业编写，其中包括学习目标、学习任务描述、引导问题、学习准备、计划与实施、评价与反馈、实际应用参考、拓展知识等。
3.创新实践教学的组织形式，改进对学生学习的评价方式
职业教育课程的逻辑核心应当是“工作实践”，因此，本课题以“工作实践”或者说“技能实践”为逻辑核心，运用任务型教学法、探究教学法等方法，通过做好分组分工，赋予学生各种角色，让学生以“职业人”的身份来学习，师生共同完成学习任务。从而促进课堂教学的转型，并完善教学评价方法，努力提高教学效果。
4.进行教学对比实践工作，检验教学效果
为了通过不同途径来检验教学改革效果，本课题以制药技术专业和药品食品检验专业学生为实验对象。其中对照组采用传统的教学方法进行教学；而实验组则采用任务型教学法来进行教学，并采用了本次课题新开发的教学大纲和工作页。
六、研究的主要结论与观点
1.在微生物实践教学内容和学生职业能力培养目标的确定过程中，我们发现最为关键的是典型工作任务的提取。本课题典型工作任务的提取主要在“工学结合”等理论指导下，针对中职学生的特点，结合微生物课程在医药类中职学校的课程设置和开展情况以及用人单位的需求来进行。
2.本课题开发了微生物学实践教学工作页，主要经过这样的程序：“相关学生、学校、企业调研制订计划开发工作页相关教学人员和企业专家的研讨教学实践反馈修改”。工作页的编写应结合专业的课程设置、专业就业方向和企业的需要来设计，编写时重点把握两个要素：学习者和学习的内容，并以学习任务为一个课业编写。在工作页的使用过程中应充分体现学生的主体地位，教师应遵循行动导向的原则实施教学，并应处理好角色转换。
3.职业教育课程的逻辑核心应当是“工作实践”，因此，本课题以“工作实践”或者说“技能实践”为逻辑核心，运用任务型教学法、探究教学法等方法，改革创新微生物学实践教学设计，从而促进课堂教学的转型；并完善教学评价方法，从而提高教学效果。任务型教学法主要通过五个教学环节实施：学习准备；问题导入，接受任务，学习研讨与解难，制订实践计划；实施与记录；分析与总结，探究与拓展；评价与反馈。实施过程中可加入探究等元素，从而进一步调动学生学习积极性和主动性。
七、今后的研究设想
有效的教学不仅学生能够有收获，教师也能有所提升。通过本课题研究的开展，教师们深深感受到教学改革的必要性，教师主导地位的重要性。教师适时的、有效的指导是十分必要和重要的。教师如何指导学生完成任务，工作任务完成的过程中应如何引导，何时介入，介入多少，哪些指导是必要的，怎样指导才算是充分的。这些都将需要我们在长期的实践过程中不断摸索和完善。同时也要求作为教师的我们要不断地完善和充实自己，以便在课堂教学中能充分展示教师的人格魅力。
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微生物学研究方法篇9
关键词：生物传感器；甲醛；研究进展
abstract:inviewofthedetectionofformaldehydecontentbecomeanincreasinglyimportantindicatorinthehumanhealthandenvironmentalprotection,andtheresearchofformaldehydebiosensorhasbecomeafocusinthefieldofformaldehydedetectionresearch.thispaperreviewsrecentresearchinthefieldofformaldehydebiosensor,technologyapplication,andprospectthedevelopmenttrendsofthefutureformaldehydebiosensoronthetechnologiesandapplications.
Keyword：biosensor,Formaldehyde,advancesinResearch
中图分类号：tQ326.51文献标识码：a文章编号：
1前言
随着社会经济的发展以及人们生活水平的提高，甲醛已成为当今污染监测的一项重要指标，快速准确地检测甲醛对于人类健康和环境保护具有重要意。甲醛(HCHo)是一种无色、易溶、具有强烈刺激性气味的有机污染物。目前测定甲醛的方法主要有分光光度法、电化学法、荧光法、色谱法、电化学传感器法等[1]。上述方法的主要缺陷在于需要现场采集样品，再到实验室内进行分析，不能满足快速、实时在线检测和连续检测等要求[2]。而传统的电化学传感器虽然制作简单、成本较低、产品性能稳定，但其所受干扰物质多，且电解质易与被测甲醛气体发生不可逆化学反应[3]。甲醛生物传感器是一种生物敏感部件传感器，能对特定的生物活性物质或化学物质具有高选择性和反应的分析装置。按功能区分为酶传感器、组织传感器和微生物传感器。具有特异性好、检测速度快、在线分析能力强、灵敏度高等优点[4]。
2甲醛生物传感器原理
甲醛生物传感器分为为酶传感器、组织传感器和微生物传感器。目前在酶传感器和为身体微生物传感器方面的研究较为深入。上述的几种传感器方式都基于甲醛脱氢酶对甲醛催化的作用。甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase,FaDH,eC1.2.1.1)是中等锌链醇脱氢酶家族中的一员，存在于绝大多数原核以及所有的真核生物中，对生物体内的甲醛解毒具有重要作用[5]。大部分FaDH都需要naD+和谷胱甘肽(GSH)参与甲醛的氧化作用，而来自恶臭假单胞菌pseudomonasputida)的甲醛脱氢酶(paDH)是目前发现的唯一一个不依赖GSH参与甲醛氧化的脱氢酶，在有辅因子naD+存在时paDH可把游离甲醛直接氧化为甲酸。
目前研究的甲醛生物传感器中，甲醛脱氢酶的催化机理是关键。如何检测反应过程中的电信号，如何保证能naD+的循环存在是关键。这里介绍一种利用苯醌为介质的甲醛传感器原理。甲醛在甲醛脱氢酶（FDH）的催化下将naD+还原为naDH，naDH进而将苯醌还原为对苯二酚，对苯二酚再夺取电极上的电子产生电流。通过对电流的测量即可检测出微量气态甲醛的浓度[6]。
图1甲醛酶传感器的反应原理
3甲醛生物传感器的研究
3.1甲醛微生物传感器
微生物传感器分为电化学型微生物传感器和生物发光型微生物传感器，电化学型微生物传感器根据测量信号的不同可分为电流型微生物电极和电位型微生物电极，又可根据微生物与底物作用原理的不同分为测定呼吸活性型微生物电极和测定代谢物质型微生物电极。
1－塑料管，2－内充液，3－聚四氟乙烯薄膜，4－压帽，5－微生物，6－金电极，7－ag/agCl
图2微生物电极结构示意图
汤鸿雁等[7]研究了将枯草芽孢杆菌制备固定化膜，以极谱型溶解氧电极作为换能器组成微生物传感器，测试了其对甲醛的响应情况。实验表明温度为(33.5±0.5)℃、pH6.76、底液中GGa的浓度为18mg•L-1时枯草芽孢杆菌对甲醛响应最敏感，相对甲醛浓度的线性响应范围为0.005～0.2mg•mL-1。固定化菌膜的保存时间超过60天。
微生物传感器技术是甲醛监测的新兴技术。目前仍有许多不足之处有待进一步研究，例如制备固定化膜存在个体差异，甲醛测试微生物传感器不够规范化等缺点，但是，随着固化技术和方法的进一步研究，其特异性和稳定性的优势会更高效的发挥出来。
3.2甲醛固定化酶传感器
甲醛固定化酶传感器是基于对甲醛脱氢酶作用原理研究的不断深入而出现的。目前的研究表明，甲醛在甲醛脱氢酶(FDH)的催化下生成甲酸和还原型辅酶Ⅰ(naDH)，通过检测甲醛酶催化反应中生成的naDH可以实现对甲醛的检测。利用甲醛脱氢酶催化原理检测甲醛的相关研究在近年取得了重大进展。
Shimomura等研究了利用电化学生物传感器检测甲醛的新方法。其将甲醛脱氢酶固定化到的介孔氧化硅材料(FSm8.0和p123-m)上、介体为苯醌以及电极，研究表明该传感器检测水溶液中的甲醛低限为1.2mol/L，这种传感器表现出高灵敏度、高选择性、高重复和良好的储存稳定性的优点。YewpeiLing等[将醇氧化酶固定到改性丙烯酸酯微球上制成用于检测甲醛的生物传感器，甲醛传感器的线性范围0.3－316.2mm，灵敏度为59.41±0.66mV/（R2＝0.9776，n＝3），检测下限0.3mm，重现性3.16%。
黄积涛等[8]发明了一种检测甲醛气体的酶生物传感器，它利用酶的高催化活性和高度特异性，通过微孔聚四氟乙烯膜采集，用于对痕量气态甲醛浓度的检测。甲醛在甲醛脱氢酶的催化下经naD+和苯醌传递电极中的电子，通过电流检测可对甲醛气体的浓度进行测量。
通过甲醛脱氢酶固化制作的传感器是目前研究的较多的热点，其产品类别也多种多样，目前实验室研究也正在不断的向实用性高的产品转变，随着对其研究的深入，甲醛固定化酶传感器的高特异性、响应速度将会更加快速的转化成产品中。
3.3甲醛生物传感器的应用
微生物学研究方法篇10
关键词稻田；保护性耕作；秸秆；微生物量碳；土壤有机碳
中图分类号S153.6文献标识码a文章编号1007-5739（2016）09-0201-02
abstractafterreturningtothedifferentamountofstrawreturnedandatdifferenttimes，theresearchesonthechangeofsoilmicrobialbiomasscarbonwereconducted.theresultsshowedthat，comparedwithconventionaltillage，soilmicrobialbiomasscarboncontentincreasedsignificantlyofconservationtillageinpaddyfield.Understrawreturnfieldbroadcastdirectlywheatanddirectlyrape，soilmicrobialcarbongraduallyrisingtrendovertime，andunderthedifferentamountofstrawreturned，thechangetrendofsoilmicrobialbiomasscarbonisstrawreturningfullamount>strawreturninghalfamount>conventionaltillage.
Keywordspaddyfield；conservationtillage；straw；microbialbiomasscarbon；soilorganiccarbon
稻田保护性耕作（conservationtillageinpaddyfield）是指水稻、小麦或油菜两季种植不间断地进行免耕栽培，稻、麦、油菜收获后及时将秸秆均匀覆盖还田，水稻采用抛栽，小麦、油菜实施撒播。对农业肥料减施、节本增效和农田生态环境保护具有积极意义[1-2]。
微生物量碳（mBC）是土壤碳素养分在转化和循环研究过程中的重要参数，它可以很清楚地反映土壤微生物和土壤肥力状况，其含量可以作为研究不同耕作方法引起土壤生物学性质变化的一个指标[3-5]。近20年来，人们在重视研究耕作方式对土壤物理与化学性质影响的同时，也不断加强了耕作方式对土壤微生物学特性影响的研究[6-10]。但对于川中丘陵区稻田保护性耕作制度下土壤微生物量碳的变化还研究很少。因此，本文以简阳市为例，研究川中丘陵区稻田保护性耕作制度下土壤微生物量碳的变化，以期为该地区稻田保护性耕作提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验地概况
试验地位于川中丘陵区偏西部的简阳市，属中亚热带湿润气候区，土壤类型为水稻土，肥力中等，呈微酸性。
1.2试验设计
试验设6个处理：水稻―小麦秸秆全量还田（7500kg/hm2），免耕，撒播小麦（a）；水稻―小麦秸秆半量还田（3750kg/hm2），免耕，撒播小麦（B）；常规耕作，直播小麦（C）；水稻―油菜秸秆全量还田（7500kg/hm2），免耕，撒播油菜（D）；水稻―油菜秸秆半量还田（3750kg/hm2），免耕，撒播油菜（e）；常规耕作，移栽油菜（F）。小区面积共105m2（7m×15m）。
1.3取样方法
对稻田保护性耕作小麦、油菜栽种不同时期土壤中微生物量碳变化情况进行研究，根据作物生长周期和气候变化特点，采样时间共分4次，分别为2012年9月、2013年3月、2013年4月、2013年5月；采取土样时，考虑到保护性耕作对土层的破坏较小、秸秆腐熟后残留物主要在表层土壤中的情况，采集0～5cm土层为供试土壤，采用“S”形随机取样的方法，并对采集的土样用四分法进行处理。
1.4测定内容与方法
1.4.1前处理。采用氯仿熏蒸浸提法[8]。采集后的土样在室温下培养71d，称取相当于烘干土重20g湿土，放人100mL的小烧杯中，连同盛有60mL不含酒精氯仿的小烧杯放入真空干燥器中熏蒸培养24h，取出、去除残留在土壤的氯仿，再加入0.5mol/LK2So4（土水比1∶2）浸提液，振荡30min（25℃，200r/min）后迅速用中速滤纸过滤。同时，另取等量土样，直接用0.5mol/LK2So4浸提，处理做空白。
1.4.2微生物量碳和土壤有机碳的测定。取浸提液10mL于消煮管中，并加入10mL0.018mol/LK2Cr2o7・H2So4溶液，摇匀后置于（175±1）℃的磷酸浴中煮沸10min，冷却后将溶液转移到150mL的三角瓶中，总体积约为80mL，加0.6mL邻苯氨基苯甲酸指示剂和5mL浓硫酸，用0.05mol/LFeSo4溶液滴定至终点。土壤有机碳的测定采用重铬酸钾-外加热法。计算公式如下：
微生物量碳（mg/kg）=2.64×ec（1）
式（1）中，ec为熏蒸与不熏蒸土样有机碳的差值，2.64为校正系数[11]。
土壤有机碳量（mg/kg）=0.012/4×106×m（V0-V）×f/w（2）
式（2）中，m―FeSo4溶液浓度，V0―滴定空白所耗FeSo4体积，V―滴定土壤浸提液所耗FeSo4体积，f―稀释倍数，w―烘干土重，0.012―碳的毫摩尔质量，106―换算系数。
2结果与分析
2.1微生物量碳的变化
研究结果（图1、图2）表明，土壤微生物量碳在不同耕作栽培制度下，随时间的推移，从2012年9月至2013年5月土壤微生物量碳呈持续增长的趋势，在5月达到最大值。在相同的时间下，稻田保护性耕作与常规耕作相比，微生物量碳呈增大的趋势，以稻草全量还田直播处理为最高，其趋势为秸秆全量还田>秸秆半量还田>常规耕作。
2.2微生物量碳与有机碳的关系
2.2.1土壤微生物量碳和土壤有机碳量的变化。结果（表1）表明微生物量碳含量随时间的增加而不断增加，在撒播小麦和撒播油菜的处理中，均以常规耕作的微生物量碳含量最低，其次为稻草半量还田，稻草全量还田微生物量碳含量最高。说明稻田保护性耕作能有效增加土壤微生物量碳的含量，从而增加土壤肥力。
研究发现，微生物量碳在土壤有机碳量中所占比例也随着时间的推进不断增加，并且到2013年5月时，微生物量碳占土壤有机碳的比例为常规耕作
2.2.2土壤微生物量碳与土壤有机碳量间的相关性。对小麦地土壤有机碳和微生物量碳的相关性进行了分析，结果（图3）表明，土壤有机碳与微生物量碳的相关性达极显著水平（r=0.933**）。同时对油菜地土壤有机碳和微生物量碳的相关性进行了分析，结果（图4）表明，土壤有机碳与微生物量碳的相关性达极显著水平（r=0.880**）。
3结论
（1）秸秆施入土壤后，随着时间的推移，不断腐熟，供给微生物生长繁殖所需的营养物质增多，土壤微生物碳量与常规相比有明显的提高，其规律为全量还田>半量还田>未还田。
（2）同时本研究的结果表明，土壤微生物量碳与土壤有机碳的变化规律一致，并经过相关性分析的结果表明，土壤有机碳与微生物量碳的相关性达极显著水平。
4参考文献
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