细胞生物学的技术篇1
细胞生物学是以细胞为研究对象，从整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点，研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的生活史和各种生命活动规律的学科。它作为生命科学的四大前沿学科之一，与分子生物学、神经生物学和生态学并列[1]，是学习分子生物学和遗传学的基础。随着该学科新技术和新方法的建立，细胞生物学已成为各大高校医学、农学和生物学等专业的一门必修课[2]，反应出细胞生物学在未来生命科学领域的重要性。自从我校生命科学院成立以来，细胞生物学就是生物科学、生物技术专业的学科基础、必修课和主干课，是学生在我校的医学大背景下理解疾病形成中的遗传和分子生物学过程的基础，是理解包括分子靶向、干细胞疗法等新颖的转化医学手段的基础，其学科地位不可替代。
二细胞生物学教学中存在的问题
随着先进生命科学“大数据”时代的到来，无论是基础理论还是应用技术研究，细胞生物学都处于生命科学最活跃的领域，知识更新快、内容丰富且深奥难懂。我院生物技术专业的本科学生多为专业调剂，初高中生物学基础知识欠扎实，学科兴趣不足，学生自主学习的能力较弱。如果教学只按图索骥照本宣科，根本无法调动他们学习的积极性。另外，课本知识过于陈旧，无法适应新时代学科发展的需要。尽管近些年部分教师已开始引导学生通过查阅文献、综述总结的方法接触细胞生物学领域最前沿的知识，但大多止步于盲目填鸭式罗列国外文献数据，没有加以甄别和指导，学生很容易在复杂的信息和数据中丧失学习的信心。
因此，如何使细胞生物学教学紧跟学科发展的步伐，使学生在有限的学时中既能具备扎实的细胞生物学基础知识和基本技能，又使学生及时掌握最新的细胞生物学理论和应用技术，能为他们将来的考研深造学习阶段和日益剧烈的职场竞争中打下良好的基础，这成为生物技术专业本科生细胞生物学教学中待解决的问题。仅靠教师讲授为主的传统教学方法和教学模式已不适应目前学科的发展和人才培养的需求，难以提高教学质量。
三以问题为导向的教学方法（pBL）的优势
1969年美国的神经病学教授Barrows在加拿大的麦克马斯特大学首创了一种以问题为导向的教学方法——pBL（problem-Basedlearning）教学法[3]，它倡导让学生通过自学、分析、讨论和合作解决问题，从而培养学生自主学习能力，发展学生综合思考能力。这种以问题为基础，以学生为主体，以教师为导向的启发式教育，以培养学生的能力为教学目标的教学方法与传统的教学方法相比有诸多优势。
1突出学生的主体地位
pBL教学法强调以学生的主动学习为主，而不是传统教学中的以教师讲授为主;通过设计真实性任务，强调把学习融入到复杂的、有意义的问题情景中，通过学习者的自主探究和合作来解决问题，从而学习隐含在问题背后的科学知识，培养解决问题的技能和自主学习的能力[4，5]。
2提高学生对细胞生物学的学习兴趣
细胞生物学基础知识内容较多且大部分深奥难懂，传统教学模式主要通过教师制作丰富的多媒体课件将知识灌输给学生，起初能够激起学生兴趣，但随着知识的不断深入，学生就会感觉枯燥无味，学习的积极性大大降低。而pBL教学可通过设计与日常生活息息相关的医学实践问题，使学生充分认识自己的主人翁意识，主动运用细胞生物学知识解决这些问题。这种“提出问题——解决问题——归纳总结”的教学方法不但使学生巩固了先前学过的知识，而且激发了他们主动学习新知识的动力。
3拓宽了学生的知识面
pBL教学中，为了解决教师提出的问题，学生必须查阅相关文献和收集材料。在这个过程中，学生不仅可以掌握本课程重点内容，而且可以了解相关领域的热点以及前沿进展，拓宽了学生的知识面，有利于知识的理解和融会贯通。
4培养了学生团队协作意识
pBL教学中需要小组成员分工查阅、收集和整理材料，一起合作讨论、总结、制作多媒体课件，最后安排一人进行陈述。通过此过程让学生意识到团队协作的重要性，增强团队意识。经过多轮合作还有利于各位成员挖掘自己的潜力、发挥各自特长、树立自信。
5增强了教师自身素质
pBL教学过程中，教师虽然不再是主体，但导向作用不容忽视。首先在“提出问题”阶段，教师要根据本堂课应该教授的基本知识，结合该领域前沿热点，设计出合理的案例，使学生通过解决此案例，既掌握了课本知识又了解了很多相关领域的前沿进展;其次在学生“解决问题”阶段，还需要尽可能回答学生提出的问题引导学生向正确的方向查阅资料;最后在“归纳总结”部分，教师还需要运用丰富的知识对遗留问题进行解释，并对整个讨论结果进行总结。这就要求教师不仅熟练地掌握本学科及相关学科的知识，而且要深入广泛了解相关领域前沿进展，对知识具有融会贯通、灵活运用的能力。在此过程中使得教师拓宽知识面，增加知识储备，完善知识结构，促进教与学的互动，真正做到教学相长。
四pBL在生物技术专业本科生细胞生物学教学中的具体实施方法
为了能够在我院生物技术专业本科生细胞生物学教学中顺利开展pBL教学，并取得良好效果，在开课前，授课教师参加了2012年上海复旦大学举办的pBL教学培训，掌握了相关教学技能。在充分调查了我院生物技术专业本科生知识结构及对细胞生物学知识的掌握情况后，我们制定了如下实施方案。
1实施对象
浙江中医药大学生命科学学院2011级生物技术专业1个班的学生。
2教学内容的选择
我院生物技术专业属于三本专业，学生又大多为专业调剂，初高中生物学基础较弱。因此，在教学过程中，细胞生物学基础知识部分如各种细胞器的结构和功能、细胞膜系统以及细胞骨架等可采用教师多媒体教授的传统教学方法;而本学科的难点以及前沿问题，如细胞的信号转导、细胞的增殖与周期、细胞分化、细胞凋亡与自噬、Dna的损伤与修复以及基因表达调控等则采用pBL教学，以问题为基础，通过收集资料、论证、实施以及总结归纳，使学生切实感受到细胞生物学与人类日常生活间的联系。进而通过自主学习，提高学生自信心，更有利于激发学生学习兴趣。 3教师提出问题
pBL教学中问题的设计非常重要，我们遵循以下原则：第一，根据教学大纲的要求及章节重点内容，结合目前细胞生物学领域的研究热点设计问题;第二，根据生物技术专业学生知识构架，设计难易适中的问题;第三，设计结合日常生活中大家关注的生命科学问题。例如，细胞的信号转导这一章围绕G蛋白偶联受体结构和功能这一知识点，设计了G蛋白偶联受体突变与哪些疾病息息相关？与肿瘤相关的信号转导途径有哪些，如何预防和治疗？针对细胞分化这一章的干细胞这一重点知识，设计了干细胞的临床应用情况如何？干细胞与器官移植等问题。
4学生分组查阅资料
问题提出以后，要分组解决问题。每组5人，分别设立组长负责本组问题的分工、督促查找资料和组织组内讨论等任务。提前一周将问题分发给学生，各小组经过充分的调研和讨论选取共同感兴趣的问题。根据分工，各小组成员开展工作。同时要求教师配合每个小组，随时与各小组进行沟通和答疑。
5课堂讨论
各小组根据分工将材料做成ppt，由组长进行10分钟陈述，组员补充，其他组进行质疑和指正。若交流中出现学生解决不了的问题，教师适当进行启发和引导，如果问题仍解决不了，则由教师解答。
6总结归纳以及教师评价
课堂讨论结束后，首先，学生对本组存在的问题进行归纳总结，自我评价学习过程和学习结果，思考知识、技能、小组成员协作和认知策略各方面的收获。其次，教师应对各小组信息是否完整与前沿、是否有创新与团队合作性、整理资料是否有逻辑性与条理性、是否按时完成、小组成员在小组讨论时的参与积极性以及各组的汇报是否精彩等方面进行评价。同时对于表现优异的小组给予适当奖励，进一步提高学生的参与积极性。
总之，为了提高教学质量，培养和提高我校生物技术专业学生的实践创新能力，促进学生综合素质的提高，我们积极进行教学改革。在结合细胞生物学课程特点和生物技术专业学生实际情况下，我们将pBL教学模式引入课堂，并且获得了较好的教学效果。我们希望通过pBL教学模式的实施，能够充分激发学生的学习兴趣及积极性，培养出具有良好学习能力、实践能力及创新能力的高素质人才。
参考文献
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[4]mancyLJ，annmp，annL，etal.Developingaproblem-
细胞生物学的技术篇2
关键词细胞工程教学改革生物技术
中图分类号：G642文献标识码：a
细胞工程是理论与实践结合的综合性很高的一门学科，是应用细胞生物学和分子生物学的原理方法，在细胞水平上研究、改造生命遗传物质，以获得具有目的性状的细胞系或生物体的理论和技术的学科，它既是现代生物技术的重要组成部分，也是现代生物学研究的重要技术手段和工具，在高校生命科学及相关学科的课程设置中占有重要地位。①
在食品学科和食品生物技术专业上，细胞工程应具有有别于生物学科的教学内容和应用实例。结合食品生物技术专业的教学目的和现有教材，在课程内容上进行调整，注重其在食品生物技术上的特色和应用，并保持教学内容系统性与完整性，保证授课内容的全面、趣味、实用。站在现代科学发展的前沿，掌握生物工程领域科技发展的最新动态，及时把这些动态、研究成果以及有待攻关的技术和课题融入教学内容，激发学生学习探索新知识的兴趣，提高学生的综合能力。为此，本文对该课程的改革进行了如下的探讨。
1对教学内容的改革
1.1精选教学内容
教学内容是教学的核心，是教师给学生传授的知识和技能，灌输的思想和观点，培养的习惯和行为等的总和。随着对教学改革的开展，教学内容具体为教学过程中同师生发生交互作用、服务于教学目的达成的动态生成的素材及信息。
对于细胞工程来讲，涵盖了植物细胞工程和动物细胞工程两部分内容，在通常的专业设置上，各学校会根据自己的研究和应用领域，侧重于植物细胞工程或者动物细胞工程。在教学内容上，通常在植物细胞工程中会涉及植物组织和细胞培养、快速繁殖、原生质体培养、单倍体育种等内容；在动物细胞工程中会涉及动物的细胞培养、组织培养、单抗的生产、转基因动物的获得等内容。②
在食品学科和食品生物技术领域，植物细胞工程和动物细胞工程的知识都要涉及，简单来说植物细胞工程为食品来源提供基础研究手段，动物细胞工程可以为食品的功能性、安全性提供研究方法。植物细胞工程可以为学科建设和学生的知识体系提供包括组织培养、细胞培养、转基因技术等在内的知识，这些内容会应用在植物有用次生代谢物的生产方面，忽略传统生物学科中的人工种子、单倍体育种等偏重于生物学和农学的内容；动物细胞工程中的组织和细胞培养，不仅可以提供食品中功能成分研究的体系，还是一种重要的研究手段和生产方式。所以，本研究从植物细胞工程和动物细胞工程两方面选择在食品学科和食品生物技术中有理论和应用价值的内容，对细胞工程原理的教学内容进行更新。
结合以上所述食品学科特点和细胞工程学科特点，本课程主要围绕以下几个方面展开：一是细胞工程基础，包括基本概念，主要研究内容，细胞培养的基本设施、条件、方法和技术等；二是植物细胞工程，包括植物组织培养、脱毒与快繁、原生质体融合、转基因技术等；三是动物细胞工程，包括动物细胞培养、细胞融合、细胞重组与克隆、转基因动物与生物反应器等；四是细胞工程的实践与应用，包括细胞工程及其相关技术的发展现状与应用进展，及其产业化发展前景等。把最新的科技发展成果融化到教学内容中，提高教学内容先进性、科学性；精选整合教学内容，注重理论并联系在食品生物技术中的研究和应用。
1.2补充教学内容
在食品生物技术中，需要补充通常的生物技术中不会涉及的内容，如在植物组织和细胞培养生产有用的次生代谢物部分，通常来讲会涉及像黄酮类、萜类等有药用功效的次生代谢物，而对于食品生物技术专业来讲，选择一些色素类、香料类物质的次生代谢，可能应用在食品工业上的物质更符合专业特点。在动物细胞工程中，转基因动物内容的设置需要淡化，对于本专业来讲，动物细胞和组织培养在食品的安全性和功能性的检测上的作用和意义则显得更为重要。
1.3开展细胞工程在食品生物技术中的应用讨论
面对近年来层出不穷的食品安全环节出现的问题，作为生物技术专业的重要课程之一，细胞工程应该提供学生发现、分析、解决该问题的思维方式，如对膨胀素在西瓜早熟过程中的作用、某些食品成分的安全性问题。在细胞工程课程中，学生能够了解细胞融合、杂交育种和转基因技术的差异，可以在他们的知识层面开展一些针对性的分析和讨论。提高社会民众的素质，应该至少从专业的学生做起，让他们具有分析问题、解决问题的能力。
2对实验教学环节的改革
实验教学是对理论学习的有效验证和补充、延伸，在改革理论教学的同时，实验教学应当同步调整。细胞工程学是一门实验性很强的学科，某种意义上讲，细胞工程仍然是一种方法和技术，而且与其它生物技术课程交叉性很强。③在细胞工程的实验教学过程中，选取代表性的，能够体现细胞工程特点和技术的内容进行开展。④⑤如在植物细胞工程的组织培养环节，通常的生物技术课程会选择烟草等模式植物进行再生，虽然说烟草作为模式植物在通常的研究过程中具有普遍性，但是在食品生物技术专业，应该就具有食品特色材料进行展开，比如胡萝卜、番茄等的组织和细胞培养，在培养技术和过程上具有普遍性，从材料上和应用性上比较贴近食品。
改变通常的实验教学内容零散、断续和不相关的特点，在植物细胞工程部分，整个实验内容自成体系，每个实验环环相扣，而这一系列实验要求学生掌握基本的操作技能，对细胞工程的理论知识和实验技能有个系统的、完整的认识。例如，在植物细胞工程中的无菌苗繁育、快速繁殖、愈伤组织的诱导、细胞培养等，这一系列的实验，可以在老师指导下，由学生分组、选择自己的材料来完成，由此学生不仅可以掌握实验技能，还能更好地理解和应用所学知识，真正地将理论和实践联系起来。
3改革教学方法
3.1采用启发式、探究式教学方法
作为综合技术课程，细胞工程的各章节逻辑性不强，理论表述较少，应用技术细节较多，给欠缺基础知识的学生在理解、记忆课本内容时带来较大的难度。因此，在教学过程中，要大力提倡启发式、问题探究式、讨论式、训练与实践式教学方法，鼓励学生大胆质疑、自由探索，最大限度地发挥学生学习的主动性、积极性和创造性。⑥在讲授细胞重组与克隆过程中，只讲解细胞重组和克隆相关原理，而克隆的最新进展则由学生在查阅资料后，对其做讲解和归纳总结，由教师和其他学生给予评价和修正；并在介绍各种技术后，通过自主查阅文献，学生会发现更多自己更感兴趣的应用。
3.2应用现代教学手段，提高教学质量
细胞工程是一个基础性和实践性很强的学科，课程的信息量大，内容基本是微观水平，传统的教学模式无法为学生呈现如此大量的课程内容，而且也很容易引起学生对课程的懈怠，降低学习兴趣，影响教学效果。为了提高教学效果，以计算机为工具，通过多媒体、教学录像、网络资源等现代化教学手段，不仅可以向学生提供丰富多彩的教学信息，还可以提供更加美观的人机交互界面，充分调动学生的情绪、情感、注意力和兴趣。使那些抽象的、在普通条件下难以观察到的、生长周期长的过程直观而形象地展示出来，有利于培养学生独立灵活地分析问题、解决问题的能力，提高教学质量，同时激发学生的学习兴趣。⑦
3.3给予学生思考空间，提高学生提问能力
在我们的教学过程中，常常会发现学生在听讲，但是却没有深入思考，其中的一个表现就是没有提出问题。究其原因，在教师方面，没有留给学生思考的空间，没有诱导他们去思考；在学生方面，习惯于接受固定的、不需要质疑的知识，而在教学过程中的没有质疑、没有问题，某种程度上体现教学环节上的缺失，影响整体的教学效果。而提问、讨论的环节，无疑会帮助学生对知识理解得更加清晰，而且还可以提高学生的综合能力。对于食品生物技术专业来讲，知识跨越了食品和生物两个学科，简单的知识在日常生活中可见，复杂的生物学问题在科研中探讨，所以从这个角度来讲，在本专业中开展提问、讨论的教学方式是可行的，可以通过多重方式来诱导和实现。
4结语
在细胞工程的课程改革中，我们的目标是调整为符合食品生物技术专业设置的教学目标的教学内容，采用能够现代化的教学手段，充分激发学生的学习热情，能够提升学生发现问题、思考问题、解决问题的能力，培养出掌握专业理论和专业技能、综合素质高、能力强的人才。本文对细胞工程教学的改革尝试，从教学内容、教学手段、实验教学等角度进行的思考和尝试，应用在教学过程中，并在此过程中进一步进行调整和补充，希望对食品生物技术专业的教学效果提升和知识体系建设有所启发和帮助。
课题项目：中国农业大学教学研究项目，项目编号201246
注释
①王蒂.细胞工程学.中国农业出版社，2003.
②赵会敏.生物技术专业动物细胞工程课程的改革与思考.广西大学学报（哲学社会科学版），2011.33（6）：172-173.
③刘清波，黄红梅，赵燕.农业院校细胞工程实验教学改革探析.现代农业科技，2010（15）：27-28.
④李艳红.细胞生物学和细胞工程实验教学的几点体会.实验室研究与探索，2004.23（7）：51-52，66.
细胞生物学的技术篇3
【关键词】治疗性克隆；细胞核;移植；胚胎干细胞
1治疗性克隆概述
治疗性克隆（therapeuticcloning）是体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术结合的产物，将成为人类医疗历史上革命性的技术.该技术首先应用患者体细胞，如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞，作为核供体，移植入去核的人卵母细胞，获得克隆胚胎；然后从克隆胚胎分离建立胚胎干细胞系；并将这些胚胎干细胞在一定条件下，诱导分化成所需要的各种类型的细胞用于治疗目的［1，2］.目前已报道，将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症［3］，将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者［4］.从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞，移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应.另一方面，每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植，由于胚胎干细胞可以无限传代，在数量上可以保证治疗的需要，从而解决可供移植的细胞、组织和器官来源严重不足的瓶颈问题［5］，为人类健康和长寿提供了新的希望.
近年来，利用核移植技术和胚胎干细胞技术相继建立了人核移植胚胎干（nucleartransferembryonicstemcell，nteS）细胞系和人兔异种间nteS细胞.这2项阶段性研究成果的取得，标志着治疗性克隆研究的巨大进步.韩国科学家Hwang等［6］通过核移植技术获得了人人nteS细胞.他们以健康女性志愿者的体细胞为核供体，以其自身卵母细胞为受体.在30枚核移植囊胚中，得到20个内细胞团（iCms），建成1株人nteS细胞系，可传代培养70代以上.上海第二医科大学盛惠珍研究小组［7］在国际上首次构建了人兔核移植重构胚.分别将5，42，52和60岁4个年龄组的人皮肤成纤维细胞核移入去核兔卵母细胞内，获得nteS细胞，通过原位杂交、免疫组化、核型和同源基因分析等证实nteS细胞具有人源性，并且保持干细胞的未分化特性，能形成类胚体，在一定诱导条件下可以分化为神经、肌肉等3个胚层的细胞群.200506，汉城国立大学的研究者［8］以患者的皮肤细胞为供体，以志愿者捐赠的卵母细胞为受体，利用体细胞核移植技术成功建立11株人核移植胚胎干细胞，这些细胞具有多能性，染色体正常，与供核患者的Dna一致、组织相容性抗原一致.
2治疗性克隆的应用前景
eS细胞在生物医学的各个领域均有广阔的应用前景，nteS细胞也有着同样广阔的前景，为临床治疗学、细胞生物学、生物发育学、比较动物学等研究提供研究材料和方法.
2.1临床疾病的治疗nteS细胞与普通的细胞移植治疗相比，具有革命性的进步.它以患者的体细胞为核供体，通过核移植技术获得的nteS细胞，与患者的遗传物质相同，可以消除受体对供体的免疫排斥反应，为目前多种退形性疾病，如心脏病、脊髓损伤、帕金森病、1型糖尿病等的治疗带来了新的希望.特别是一些目前还没有找出致病基因的遗传病，如脊髓侧索硬化症，nteS细胞移植是最有希望的治疗方法.目前已经应用nteS细胞在体内外分化成多种细胞，包括神经细胞和生殖细胞［9，10］.尤其Barberi等［9］建立了一套方法，能使nteS细胞向中枢神经系统细胞特定分化，能产生高效率的神经胶质细胞、寡突细胞、神经元细胞，包括多巴胺能神经元、γ氨基丁酸能神经元等，将分化的多巴胺能神经元移植到parkinson病模型后，能改善其症状.细胞治疗的途径有两种：其一，nteS细胞定向分化后移植.细胞扩增后，体外定向分化，对分化细胞进行纯化，将获得的目的细胞移植到病变部位，替代丧失功能的部分细胞；其二，nteS细胞原位移植.与定向分化后相比，nteS细胞原位移植有以下缺点：①没有经过纯化，可能将污染的异源饲养层细胞带进移植部位；②nteS细胞没有转入经选择基因，无法控制植入细胞的命运，可能发生癌变；③nteS细胞分化成分复杂，目的细胞分化成分少，可能出现大量非必须细胞的分化.
2.2细胞生物学通过研究nteS细胞的体外分化特性，可以识别某些靶基因，对人类新基因的发现，功能基因的研究，以及基因治疗的研究均有重要意义.通过探讨nteS细胞体外增殖和分化的机制，了解各种生长和分化因子的作用，为组织再生和修复的研究提供了新的工具；通过诱导nteS细胞癌变，可分析肿瘤细胞发生的分子机制.nteS细胞作为一种得天独厚的研究材料，对于阐明细胞增殖、分化、凋亡、迁徙、恶变等机制有着重要意义.自发现eS细胞以来，人们已经利用eS细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统，体外分化的多种细胞类型都曾被成功的植入胎鼠或成体鼠，在受体鼠体内形成有功能的细胞群.
2.3发育生物学由于哺乳动物在母体内受胚胎发育的个体大小和内环境条件的限制，很难系统地研究其早期的发育进展、细胞分化及调控机制等.比较动物卵母细胞质对同种或异种细胞核发育的影响，在细胞和分子水平上为研究哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供了良好的材料和方法，也为研究胚胎发育的影响因素提供了便利条件.建立在eS细胞和基因打靶技术基础上的复杂的转基因系，使人们可以建立有效的分析系统，从而在分子水平上研究不同的生物学问题.它不仅可以将一些在发育过程中对动物体非必需或可被替代的特定基因进行敲除(geneknockout)，在体内进行功能缺失研究，而且还可以研究基因在不同发育时期中的作用.nteS细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系.因此，就有可能人为地产生一些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立基因突变的模型.
3治疗性克隆面临的问题
3.1亟待解决的问题①体细胞克隆效率与nteS细胞建系效率普遍较低：核移植胚发育至囊胚的几率为19%～25％，与牛、猪的核移植囊胚发育率相当分别约为25％和26％；从克隆囊胚获得nteS细胞的效率仅有4%~16％，平均8.2%［11］.②卵母细胞来源问题：nteS细胞用于人治疗性克隆，卵母细胞的需求量是非常大的，目前尽管已有许多措施来改进核移植技术，但仍没有明显提高.要得到一个nteS细胞系平均需要12个囊胚，而所需要的卵母细胞数就更多了，一个nteS细胞系平均需要666个.如果nteS细胞系用于人类疾病的治疗，这样的代价是非常大的，即使目前报道的最高效率的建系，也是30个卵母细胞，才能得到一个nteS细胞系.另外一种替代策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞，例如兔、山羊等.③伦理问题：胚胎生物技术涉及使用早期未着床的胚胎，特别是治疗性克隆技术还将无法避免的使用通过体细胞克隆获得的人的早期克隆胚胎.世界各国尤其是西方国家对此争论很大［12，13］.迫于社会公众与宗教的压力，大多数西方国家对治疗性克隆技术应用于人类，持反对态度，不允许国家科研经费支持治疗性克隆的研究.④临床应用问题：如eS细胞系可能在培养过程中出现染色体非整倍性问题，eS细胞定向分化能力及分化细胞的稳定性问题；其次，异种核移植产生的人动物重构胚还存在安全性问题：异种重构胚在发育早期含有2种线粒体，以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体，但受体卵浆中所带的异种蛋白，包括细胞器及mRna，它们的命运如何，是否也像线粒体一样完全被供核体所取代，还有待进一步证明.再次，在核移植的过程中，可能存在跨种间病毒传染，例如，人兔核移植胚胎干细胞，有可能将某些目前未知的兔疾病传染给人类，就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来那样.
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3.2建立我国知识产权的治疗性克隆技术随着干细胞技术和体细胞核移植技术的研究进展，我国学者在治疗性克隆的技术方面也处于世界前列.当前，在我国研究和发展治疗性克隆技术，建立我国知识产权的治疗性克隆的细胞产品，创建细胞治疗产业，是一个很好的机遇.我国在治疗性克隆研究领域的优势：①目前，我国在哺乳动物克隆技术的研究方面处于国际先进水平，相继成功克隆出了牛、羊等动物.1991年，西北农林科技大学生物工程研究所在世界上首次获得山羊胚胎细胞核移植成功，共得到5只羔羊.1998年，该研究小组用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作供体，采用细胞质内直接注射的方法将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，胚胎激活后移植到受体母羊子宫角，获得了2只体细胞核移植后代，这是世界上首批成年体细胞克隆山羊，并获得了克隆山羊的第4代后裔，目前仍生长健康.②宽松的人文环境.中国公众有着不同于西方的伦理观念，对于动物权利和早期胚胎的担心没有西方国家严重，也基本没有因为宗教信仰而反对胚胎生物技术的问题.③法律和法规的基本保证.为保证和促进人胚胎干细胞研究的健康发展，国家科技部和卫生部联合下发了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》，使治疗性克隆的研究合法化.但我国明令禁止克隆人和买卖人类胚胎.
然而，中国的优势不能在治疗性克隆的研究领域走在国际前列，主要原因是经费不足和相关学者缺乏协同研究.应用克隆技术结合胚胎干细胞体外诱导分化和细胞治疗方法的关键是技术问题.我们希望临床学者与基础细胞生物学家联手合作，借鉴国外的思路，应用自愿者的卵母细胞，建立中国人的nteS培养技术，为治疗性克隆的临床应用奠定基础.我们坚信，中国有可能在这个领域走在世界前沿.
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细胞生物学的技术篇4
[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构
[中图分类号]Q819[文献标识码]a[文章编号]2095-0616（2016）05-40-04
一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。体细胞核移植（somaticcellnucleartransfer，SCnt）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。核移植（nt）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代。随着胚胎工程技术的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培育出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有标志意义的是1997年Roslin、研究所的wilmut等，首次在世界上报道了他们利用体细胞核移植技术，用成熟绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一实验充分证明了高度分化的体细胞仍然具有全能性，人们可以利用体细胞，通过体细胞移植技术获得基因型与供体细胞基因型基本相同的子代个体。成为了生物学以及遗传学发展史上一个重要的里程碑事件。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者patrickChesne等用卵丘细胞作为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的应用研究提供了方法。应用这项技术，2006年我国学者李善刚博士应用成纤维细胞作为核供体成功地培育出克隆家兔，在此基础上他又进一步将转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，成功培育出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技术推向新的高度。
1体细胞核移植的主要方法
具体来讲，体细胞核移植技术主要包括受体细胞的去核、核供体细胞的准备与选择、细胞周期的调控、细胞融合、重组胚胎细胞的激活以及培养等步骤。
1.1受体细胞的选择
在哺乳动物体细胞核移植的实验中，可以作为受体的细胞主要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的mⅡ期成熟卵母细胞；（3）去核的早期胚胎细胞，其中mⅡ期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需要的各种细胞因子在mⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分充足。在细胞分裂过程中，结合在Dna上的各种细胞因子如转录因子等从Dna螺旋轴上脱离下来，与此同时胞质中的大量重组因子即可与Dna螺旋轴结合，从而促进基因重组的发生。另外一方面，因为选择合适卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否能够成功产生巨大的影响，故细胞培养的时间也特别重要，实验中一般多选择培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为大量的实验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。
1.2受体细胞去核的方法
先要对受体细胞进行去核，才能进行供体核的移植。受体细胞去核必须完全，如果去核不完全，一方面可能导致重组的胚胎细胞染色体形成非整倍体或多倍体从而使克隆直接失败，另一方面也可能使卵母细胞产生异常分裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的早期死亡从而使克隆最终失败。所以是否完全使卵母细胞去核，是保证核移植所形成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个体的前提条件。为了减少实验中的干扰因素，可以通过缩短体外操作的时间并快速而准确的去除受体细胞核以避免孤雌发育。大体上受体细胞去核的方法可以分为两种方法，即化学去核法和机械去核法。具体有以下几种操作方法（1）盲吸法：这一方法的优点是不用借助于其他的化学物质，但此法耗费时间较长、易影响细胞质空间结构故对卵母细胞损伤比较严重，所以技术要求较高，不同动物去核率相差也较大，应用较少；（2）半卵法：这个方法是应用特制的卵母细胞切割刀，将卵母细胞切割成为两个半卵，然后丢弃含有极体的那一半半卵细胞，用两个不含极体的半卵细胞与供体细胞核进行融合，构建核移植胚胎。（3）化学试剂去核法：这种方法的原理是利用蔗糖或者脱羰秋水仙碱等化学试剂的作用，使受体细胞能够自行排出第二极体，从而实现去核的目的，但目前还不清楚化学试剂是否对受体细胞造成损伤；（4）挤压法及点压法：此两种方法均是利用固定管固定住细胞，使细胞染色于特定位置，然后挤压透明带，用去核针取出第一极体，再用荧光染料Hoechest33342染色后观察其去核率。点压法是挤压法的改进方法，优点是对卵母细胞胞质的损伤较小，在去核操作的过程中不用更换去核针，节省了时间，有效的提高了去核效率；（5）纺锤体探测技术：此法去除细胞核的方法是将卵母细胞放置于Spindle-view偏振光系统的倒置显微镜下，受体卵母细胞的纺锤体区域较其它部位明亮，从而清楚显示其染色置，而后再用去核针通过显微镜下操作去核，以利于去核的操作准确完全。（6）透明带膨胀辅助去核法：此法是先用去核针吸入适量操作液后稍施正压，使吸入的操作液平缓流出，推进去核管，使透明带逐渐膨胀，然后用去核针将细胞核取出，此法的优点是缩短了去核操作的时间并且显著地提高了去核操作后卵母细胞的生存率。（7）离心去核法：这个方法的原理是根据细胞质的密度小于细胞核，通过离心的方法将没有透明带的细胞核甩向一侧进而脱离卵母细胞。该方法的缺点是必须去除透明带，不利于之后核移植胚胎的发育。
1.3供体细胞选择与核的移植
实验中可用于核供体的细胞很多，主要有胚胎干细胞（eS细胞）、卵丘细胞、颗粒细胞、支柱细胞、细胞、乳腺细胞、神经细胞以及成纤维细胞等，其中最主要的是两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。影响核移植成败的一个重要因素是受体与供体细胞的细胞周期同步化发育，早期的研究认为要使体细胞核移植成功必需使供体细胞处于Go期，获得Go期细胞主要是通过两种方法：选择细胞类型或者人工诱导的方法。inoue等研究人员在小鼠的核移植实验中发现，移植的效率较大的受到供体细胞的细胞类型以及其基因型的影响。近年来许多科研人员通过实验发现把没有经过休眠诱导的处于细胞周期中G1期、G2期以至于m期的细胞作为供体细胞进行核移植也可以获得成功。将供体细胞核移植进入受体细胞的常用方法主要可分为融合法以及注射法两类。其中融合法中目前最常用的是电融合的方法，这是因为电融合的方法具有细胞损害较小、可重复性好而且融合的效果较好等明显的优点，所以逐渐被广大的研究人员所应用。电融合方法的原理是通过细胞在强电场短时间的作用下，使细胞膜产生一过性的击穿，当电流使两个相邻的细胞膜接触的区域发生击穿时，两侧的细胞膜就可以在击穿的瞬间发生接触并融合成为一个细胞。注射法一般分为透明带下注射和胞质内注射。透明带下注射是把整个供核细胞注射至受体细胞卵周隙，这就需要在注射后还需使供体细胞与受体细胞进行融合。胞质内注射一般是用压电一陶瓷微注射系统，直接把供体核注入胞质内。
1.4卵母细胞的激活
因为缺少了受精这一步骤，在以成熟的卵母细胞作为受体的核移植实验中，缺少了自然受精过程中受精卵的激活过程，所以必须进行人工激活核移植后重构的卵母细胞从而促使其进一步分化发育。根据激活时期的不同，可分为移核前激活、移核时激活、移核后激活三种不同的时期。使卵母细胞激活的方法可以分为化学或者物理刺激的方法两类。激活方法目前应用较多的有钙离子载体a23187激活和离子霉素激活、乙醇激活、蛋白质合成抑制剂激活、氯化锶激活、提取物激活、蛋白质磷酸化抑制剂激活以及电脉冲激活、联合激活等。虽然卵母细胞可以被以上的各种化学物质以及物理刺激的方法激活，但是却不可避免地在激活的同时也造成受体细胞一定程度的损害，影响胚胎的发育。所以，是否能够尽快地探索出对卵母细胞损伤较小并且激活效率高的激活方法对体细胞核移植技术最终能否成功尤为重要。
2体细胞核移植技术的应用前景
体细胞核移植技术作为细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，应用前景必然是特别广阔的甚至是我们一时无法估量的！其潜在的经济效益是十分巨大的，随着这项技术的不断发展、逐步完善，必将带来生物学以及医学领域的一场深刻变革。这项技术在生物学方面如在保护濒危动植物物种、新物种的培育、优良畜种培育以及转基因动植物生产方面前景十分广阔。另外，这项技术在医疗卫生领域同样具有巨大的应用潜力和发展前景。尤其在医疗卫生领域，可能为机体损伤修复、器官移植乃至遗传性疾病、老年性疾病的治疗等打下坚实的基础，有着不可估量的作用，所以值得科研人员持续关注并为体细胞核移植技术的不断完善发展付出不懈的努力。
细胞生物学的技术篇5
关键词：细胞工程；教学改革；人才培养
中图分类号：G642.0文献标志码：a文章编号：1674-9324（2016）46-0089-02
细胞工程是以细胞生物学和分子生物学为理论基础，应用于生产实践，在细胞水平和细胞器水平，根据人们的需要和设计来改变细胞内遗传物质并获得细胞产品的一门综合性应用性技术学科[1、2]。应用型地方本科院校在师资力量、实验仪器设施条件等方面相对较弱，为了适应应用型本科院校为社会培养应用型人才的需要，提高学生的学习积极性，为学生以后走上工作岗位或继续深造奠定坚实的基础，笔者在细胞工程课程教学改革方面进行了一些初步的探索，取得了一定的成效，现总结如下。
一、教学内容改革
细胞工程是生物工程专业的一门实践性和应用性很强的专业课，也是生物工程的一个重要方面，包括植物细胞工程和动物细胞工程两方面。我校是一所地方性本科院校，有生物科学与生物工程二个专业开设细胞工程专业选修课，根据我校“注重学理，亲近业界”的才培养理念和具体专业特点，教研组组织任课教师进行讨论，确定教学内容，制定教学大纲。
在教材选择上，我们选择科学出版社出版的杨淑慎主编的《细胞工程》为教材，同时参考整合其他现有教材内容，编写教学教案，并根据细胞工程发展快的特点，在教学教案中增加近期研究新进展。
在教学内容上，不同专业教学内容有所侧重[3]；生物科学专业尤其是农业生物技术专业在教学中以植物细胞工程内容为主，动物细胞工程内容以自学加讨论的形式来完成，在教学中着重讲解植物细胞工程的原理与基础，并结合实例讲解植物无性快繁技术、植物脱病毒技术、植物细胞培养与次生代谢产物的生产技术、植物胚培养技术等；生物工程专业尤其是生物制药专业以动物细胞工程内容为主，植物细胞工程内容以自学加讨论的形式来完成，在教学内容中重点讲解动物细胞体外培养技术及细胞培养中的注意事项、动物干细胞培养与诱导研究进展、动物单克隆抗体制备原理与技术、动物体外受精与胚胎移植技术、动物染色体工程等。
在教学过程中围绕细胞工程的理论基础一基本技术手段一主要应用领域一最新研究进展一发展前景的主线进行讲解，根据具体情况适当增加细胞工程的最新进展，将细胞工程领域的研究成果引入教师教案，丰富更新授课内容，如介绍近年来诺贝尔生理学或医学奖获奖成果等，这些内容可以激发学生的学习兴趣，增强其对细胞工程的认识和探索未知领域的决心。
二、教学方法改革
细胞工程是一门专业基础课，在传统的教师课堂讲授基础上，我们探索以专题形式进行课堂教学，开学公布教学方案及计划进度，提前一周布置任务，课堂上围绕专题进行以学生为主的教学讨论，教师根据课程内容及时进行补充与总结，实现学生对细胞工程基础知识的理解和掌握。如在讲述植物细胞工程时，植物脱病毒技术作为一个专题，提前一周让学生进行预习，课堂上用学生参与的形式边讲解边提问同学生一起总结植物脱病毒技术的原理、方法、应用及成就等；在讲述动物细胞工程时，单克隆抗体作为一个专题，以1975年Kohler和milstein创立单克隆抗体生产技术，1984年获诺贝尔生理学或医学奖为引子，在课堂上让学生讲解并讨论单克隆抗体技术的理论基础、技术关键、应用及产业前景，充分激发学生的求知欲，鼓励学生积极参与到课堂教学过程中，让学生真正成为课堂的主体，变学生被动接受为主动学习。
细胞工程是近年来发展较快的一门技术性、实用性很强的专业基础课，是细胞生物学发展的实践应用，基础理论内容多，科学进展信息量大，应用性和实践性强，涉及多个实验体系和多种实验技能。根据细胞工程课程的课程特点与教学内容安排要求，为了使学生在有限的课时内充分理解领会教学内容，获得好的学习效果，在细胞工程课堂教学过程中，我们采用传统板书和多媒体教学相结合的手段，通过多媒体课件、视频和动画等现代化教学手段，展示细胞工程各种技术的原理和操作要点，把抽象的理论基础、技术关键用直观的图像演示出来，提高学生的学习兴趣，加深学生的理解，提高教学效果。
三、实验环节改革
细胞工程是一门实践性和应用性很强的课程[4]，由基本原理、基本技术、实践应用等三部分组成，根据我校实际情况，我们注重理论课教学的同时，不断完善实践教学体系，压缩原理和理论讲授学时，加大知识应用实践学时，在调整课堂理论课讲授的同时，增加了实验课和实习实训锻炼的课时，使课程结构更加适应细胞工程专业学习需求，符合我校建设服务地方的应用型本科院校的大方向。
通过多年的教学实践，在细胞工程实验教学中我们建立了包括课程实验和生产实习两个方面的实践教学体系。保留传统的基础性实验内容，如培养基配制、初代培养、继代培养、培养产物观察等内容，培养和训练学生细胞工程基础实验操作技能和细胞工程基本实验技术，并对实验内容进行整合和优化，在有限的实验课时和现有实验条件下，合理规划实验内容，使实验环节紧密衔接。结合课程内容，设计综合性实验，让学生组成团队自选实验材料、全程参与独立完成整个实验过程，从准备材料、配制试剂、高压灭菌、无菌操作到结果观察，统计分析，对学生的实验技能和实验技术进行全面的综合性训练，同时培养学生的团队协作精神和科学探究精神，也可以结合教师科研项目和大学生科技创新项目进行，提高学生的综合实验动手能力和基本的科研素质。另外组织学生观看细胞工程相关实训视频、与企业对接，参观相关企业、与企业领导和技术人员座谈交流、参加企业生产实习，真实感受细胞工程在生产中的应用，为毕业实践奠定基础。
四、考试改革
考核是教学过程中不可缺少的环节，通过考核对教学质量、教学效果的反馈进行检查，一方面，检查学生对知识的掌握程度，另一方面，教师可以在考核中发现教学中存在的问题，及时进行改进[5]。细胞工程课程考核分为三大部分，平时成绩占20%，实验成绩占30%，课程考试成绩占50%。平时成绩主要考核内容包括课堂表现（考勤，课堂提问）、专题讨论资料准备和课后作业等，是对学生平时表现的一种综合考核。实验成绩考核包括学生在实验课上的综合表现（实验报告、实验技能、实验态度等）、综合性实验和实习参观中的表现（实验实习报告、团队精神等）。期末考试在笔试试题设计上，提高主观试题的比例，降低客观试题的比例；表现为试题题型多样化，增加综合性试题和实验结果分析类题型，加强对学生分析问题解决问题能力的考核。引导学生平时加强学习，注重能力培养，防止以往教学过程中出现的期末突击复习应付考试现象，培养学生养成良好的学习态度，提高学生自主学习的能力。
细胞工程课程改革是我校生物工程专业课程体系改革的重要组成内容，其改革是一个长期的过程。我校是一所新建应用型地方本科院校，由于应用型教学师资技术基础弱、实验设施条件差，在培养应用型人才的教学目标和课程改革中对教师提出了更高的要求，在教学过程中不仅要不断学习和完善适合本校的细胞工程培养体系，更新自身的知识理论框架，而且在教学过程中要不断思考、探索和总结，与企业联姻合作，提高教学质量，为企业培养综合素质较高的具有创新能力的应用型人才。
参考文献：
[1]邵景侠，张小红，徐虹，等.《细胞工程》理论与实践教学的探索与研究[J].教育教学论坛，2015，（42）：117-118.
[2]姜振华，周大祥.地方本科院校细胞工程教学改革探索[J].教育教学论坛，2013，（27）：52-53.
[3]董丽丽.应用型本科教学背景下《细胞工程》教学改革探索[J].黄山学院学报，2014，16（3）：134-136.
细胞生物学的技术篇6
纳米技术(nanotechnology)是指在纳米尺度下对物质进行制备、研究和工业化，以及利用纳米尺度物质进行交叉研究和工业化的一门综合性的技术体系。
1．纳米尺度空间
国际上公认0．1～100nm为纳米尺度空间。为研究工作方便，有人把尺寸0．1～1μm视为亚微米体系，尺寸1～100nm划分纳米体系，典型尺寸
纳米尺度空间所涉及的物质层次，是既非宏观又非微观的相对独立的中间领域，被人称之为介观(mesoscopy)研究领域。
2．纳米技术范畴
(1)纳米材料与技术：纳米材料包括纳米微粒与纳米固体。纳米微粒通常>1nm，需用电子显微镜才能看到；纳米固体系纳米结构材料，尺寸为1―100nm的纳米微粒凝聚而成的块体、薄膜、多层膜和纤维。又分为晶态、准晶态和非晶态三类。
纳米材料技术(包括纳米相材料技术和纳米复合改性技术)是缘于纳米颗粒的性能发生了变化，从而使纳米材料在力学、磁学、热学、光学、电学、催化等性能及生物活性方面发生变化，因而被广泛应用于各种材料领域；医学上可用于人造骨、人造牙齿等。
(2)纳米器件及技术：其一，微型传感器：利用尖端直径小到足以插入活细胞内而不严重干扰细胞的正常生理过程，以获取活细胞内足够的动态信息来反映其功能状态。这将为临床相应疾病提供诊断及治疗的客观指标，也为药理学、细胞工程、蛋白质工程、酶工程等研究提供相应的材料和技术。
其二，微机器人(包括微型机器人与微操作机器人)微型机器人是指外形很小，便于进入微小空间进行可控操作的微型机器。如果机械结构能做到前所未有的微细，再集成高度的智能的话，那么人们将创造出面目全非的机械，建立一门概念全新的学科。
纳米技术能为医学做些什么
1．纳米生物学(nanobiology)研究以纳米为尺度，研究(1)细胞内各种细胞器的结构和功能(如线粒体、细胞核)(2)细胞内外之间及生物体的物质、能量和信息交换；(3)生物反应机理：包括修复、复制和调控等方面的生物过程：(4)根据生物学原理，发展分子工程，包括纳米生物分子机器人和纳米信息处理系统。
2．生物与医学工程研究
微操作机器人系统可在生物与医学工程研究中进行显微注射与显微切割，这是一项复杂的微操作过程，其精度要求在微米级。目前上述操作基本上由人工在显微镜下手动或半自动完成。手工操作效率极低，如微注射产生转基因家畜的成功率只有5％左右，一个熟练的操作人员一天大约可注射100个受精卵，而培养一名熟练的操作人员要花5年时间。
3．诊断与监测
(1)光学相干层析术(oCt)已于1997年12月24日，由清华大学单原子探测实验室研制成功，可望1999年进入临床，被科学家誉为“分子雷达”。
oCt的分辨率可达1个微米级，较Ct和核磁共振术的精密度高出上千倍。它能每秒2000次完成生物体内活细胞的动态成像，观察活细胞的动态，发现单个细胞病变，且不会像X光、Ct、磁共振那样杀死活细胞。有了如此准确的依据，人们或许有办法把疾病“扼杀在萌芽状态中”而不必等到生命的尾声才被Ct与磁共振检查出癌组织病变。
(2)激光单原子分子探测术：此术同样具有超高灵敏性，可在含有1000亿亿(1019)个原子或分子的1Cm3气态物质中，在单个原子分子层次上准确获取其中一个。按照这一办法，科学家希望对生物体尤其是人体内生物分子的活动进行探测，以找到影响人类健康的某些答案。通过人的唾液、血液、粪便以及呼出的气体，及时发现人体中哪怕只有亿万分之一的各种致病或带病游离分子(或标志体)，相信已不再是一件遥远的事情。
(3)微小探针技术可向人体内植入，根据不同的诊断和监测目的，可定位于体内的不同部位，也可随血液在体内运行，随时将体内的各种生物信息反馈于体外记录装置。此项技术有可能成为21世纪医学界常用的手段。
4．临床治疗
(1)显微外科术的革命――细胞修复术众所周知，本世纪器官移植，人工器官技术的发展，曾使得外科从修复外科时代(对病变器官与组织的切除)向替代外科时代(器官移植、人工器官)发展，并有专家预言21世纪医学仍然是替代外科为主的时代。
(2)定点给药：利用微型机器人深人体内做到定点给药，将是21世纪内科疾病治疗的革命。①糖尿病：外源性补充胰岛素，需要准确了解体内血糖的变化，且常年肌注，病人极为不便。胰岛移植的手术费用、病人痛苦以及成功率等方面都存在不少问题。利用纳米药物存储器，定点存放在人体胰岛部位，根据纳米监测器对体内血糖水平的变化情况，自动调控对胰岛素的释放。对此，日本科学家已有初步的研究成果。②肿瘤：肿瘤的放疗、化疗及外科手术以及器官移植，心血管疾病的现行治疗方法，因其功用只是弥补疾病后果或推迟死亡，尽管在大众传媒中被视为高技术的同义词，而实际上耗资巨大，已成为西方医疗危机的主要原因，故被刘易斯・托玛斯称为“半拉子”医疗技术。而纳米技术正是向类似的“牛拉子”医疗技术挑战的有力武器，因为利用纳米技术制成的“生物导弹”可导向定点给药，将肿瘤杀灭在萌芽状态之中。
机遇与对策
1．纳米技术在医学领域内的发展前景
除纳米材料在替代医学中得到广泛的应用之外，纳米器件有可能成为未来保卫人类健康的一支忠实可靠的“卫队”。(1)纳米生物传感器用于监测、收集、播送体内细胞的健康状态和病变信息(2)纳米药物存储器(药泵)用于存储、运输指定存储的药物，并按指定的部位存放，即定点给药，其体积可达数个微米(3)纳米生物导弹直接用于治疗各种细胞水平的疾病，对病变组织有亲和力，对病变细胞有杀伤力，可特异性地杀灭肿瘤细胞(4)纳米细胞修复器用于修复细胞内的各种病变，如线粒体、细胞核的病变(5)纳米细胞监督器用于监视免疫细胞、白细胞等细胞正常功能的发挥；(6)纳米细胞清扫器：帮助清除体内的代谢废物以及外界进入体内的有害物质；(7)纳米细胞检疫器：巴西和美国科学家最近发明了世界上最小的“秤”，能够称量10-9克的物体，即相当于一个病毒的重量。利用纳米“秤”可称出不同病毒的重量，以发现新的病毒。可定点于口腔、咽喉、食道、气管等外界开放的部位，以充当“检疫”。
2．迎接纳米技术的挑战
细胞生物学的技术篇7
1单细胞分离
单细胞分离的方法很多，包括显微操作技术（micromanipulation）、激光捕获显微切割技术（lasercapturemicrodissection,LCm）、微流控技术（microfluidicplatforms）等。目前在法医Dna检验中实际应用的技术平台有两种，显微操作技术和激光捕获显微切割技术。
1.1细胞染色由于在实际案件中获得的细胞，细胞形态并不是实验室理想的形态，为了更好的识别细胞，在普通显微镜下观察时需要对细胞进行染色。对于上皮细胞，我们研究组尝试了不同的染色方法，通过联用显微操作技术对龙胆紫浓度梯度及时间梯度染色进行研究发现，0.5μL龙胆紫染液（0.05g/mL）加入100μL细胞悬液，5min后胞核着色即已明显，能有效提高显微捕获单细胞分离检验技术的检测效能，另外，染色时间不影响Dna结果分析[7]。对于细胞染色，Dimartino等通过对比核固红与巴氏染色法，证实巴氏染色法不仅能清晰的观察细胞，而且不影响下游pCR扩增[8]。Sanders等通过大量的实验发现，苏木素/伊红染色法（H&e）染色后的细胞StR分型峰高下降幅度较小，不影响分型结果[9]。也可以用荧光原位杂交技术对细胞的性染色体进行标记。
1.2显微操作技术显微操作技术是在显微镜下通过微毛细管吸取单个细胞。典型的显微控制系统包含一个倒置显微镜加上一个操纵杆操作，电动精密控制平台。其优点是操作容易进行，通过显微镜直观地分离单个细胞，成本低，主要用于较小细胞群体中的目标细胞分离。该平台适合对案件中上皮细胞进行分离，3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完整分型，甚至低至一个细胞也可得到完整分型，该方法已成功应用于一起案的检验。在该案件中，提取受害人皮肤上的唾液斑，通过在镜下分离有核的口腔上皮细胞（来自于犯罪嫌疑人）和无核角化的上皮细胞或细胞碎片（来自于受害者皮肤），成功获得嫌疑人的StR分型。在案件中常碰到的血烟头检材，由于血液量大，常规方法很难获得烟头上唾液来源个体的StR分型，即使用单细胞分离检验时，也常常获得混合StR分型。本课题组在显微操作标准流程的基础上进行改进，将吸取的细胞先在tne缓冲液中清洗几次，以彻底去除血液细胞碎片和游离Dna，最终获得完整唾液来源个体的Dna分型。也有报道将显微操作分离的方法用于分离，但细胞体积非常小，直径只有约6μm，毛细管吸取操作相对困难，下面介绍的激光捕获显微切割技术平台更加适合细胞的分离操作。显微操作法存在以下几个方面的不足。第一，由于依赖手工操作，对实验员的经验与操作能力要求较高，自动化程度较低，而且玻璃吸针脆性大，操作时易碎。第二，耗时较长，操作繁琐。第三，对于涂片后的检材，必须在液体环境下进行操作，容易受蒸发的影响，检材蒸干后，再补水时容易造成检材的损失，甚至带来污染。第四，对于案件中陈旧样本，根据形态识别细胞容易出错。
1.3激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术是利用UV（320~400nm）激光切割并捕获涂于覆膜玻片上的细胞。仪器设备较昂贵，自动化程度较显微操作技术平台高，是目前法医学应用最有效的单细胞分离方法，可用于上皮细胞、细胞、白细胞等不同类型的细胞分离。目前，该平台应用较多的是案中差异裂解法无法消除女性成分干扰的精斑检材，通过在显微镜下寻找并捕获细胞以消除女性成分。由于细胞是单倍体，理论计算证明捕获15~20个未降解的细胞，有很高的可能性获得完整的StR分型，实验证明至少捕获30个细胞可获得完整的StR分型。也有学者应用悬液荧光原位杂交（suspensionfluorescenceinsituhybridization，S-FiSH）对案样本进行标记，通过这种方法可以明显减少前处理操作步骤。对于多个贡献者的混合精斑，差异裂解法不能将每个贡献者完全分离。近年来，我们研究组在这方面有深入的研究。通过联合使用激光捕获显微切割方法和低体积扩增技术，可以实现以单个细胞Dna为模板，进行Y-StR扩增检测，并成功获得三人混合精斑中各个来源人的Y-StR分型。研究组进一步使用荧光原位杂交技术标记Y型，特异性挑选Y型，通过优化组合Y-StR基因座与10个常染色体StR基因座（auto-StR），构建全新的Ya-StR复合系统。其中，Y-StR基因座用于区分不同个体，通过组合Y-StR相同的图谱，实现个体的常染色体StR分型检验。首次尝试将该技术应用于三人混合精斑的检验，准确地获得了三个个体的StR分型。近年来，我们研究组还利用该平台建立了男女混合血液样本的分离检验技术方法。该平台在寻找细胞这一步骤时耗时耗力。有研究组开发了自动化的图像识别软件，通过分析图像中的光强、颜色和形状，可实现快速识别细胞，但是对不同种类细胞准确快速的识别仍需要进一步的研究。
1.4微流控技术最近兴起的微流控技术平台因其高通量、自动化、可有效防止污染而备受关注。微流控装置封闭的操作空间可以有效地避免污染，微升至纳升的操作体积可以保证较高的样品浓度，同时减少试剂消耗，虽然目前还没有在法医学单细胞分离中实际应用，但未来有很大的发展潜力。
2单细胞裂解
分离得到单细胞后，需将细胞裂解获得基因组Dna。传统的法医Dna检测需要对基因组Dna进行纯化，而对于单细胞检验，为了避免Dna的损失，常略去纯化步骤，裂解后直接进行pCR扩增。因此，裂解步骤要保证不影响后续pCR扩增反应的顺利进行。目前主要使用蛋白酶裂解，常用蛋白酶K或protease（德国QiaGen公司），酶解后高温使胞内蛋白质及蛋白酶K变性失活，利于基因组Dna的释放和下游pCR反应。对于细胞可加入Dtt，打断二硫键，使细胞充分裂解。
3pCR扩增
一个细胞中的总Dna量仅有数匹克，常规的pCR管扩增需要的细胞数目较多，我们的研究结果显示至少20个口腔上皮细胞或60个细胞检测到identifiler®pCR试剂盒（美国aBi公司）中全部分型。最近几年发展起来的微量化反应，即芯片-低体积pCR扩增（on-chiplowvolume-polymerasechainreaction，LV-pCR）系统[23,24]，在低至1.5μL的pCR体系中，Dna模板与引物和聚合酶结合的机会明显提高，使微量细胞甚至单个细胞进行Dna分型变为现实，不仅检测的灵敏度得到提高，而且检验范围也大大拓宽了。LV-pCR使用贝克曼公司的aG480FampliGridslide进行扩增，前期大量的研究都是使用该产品进行，而且实验证明该产品灵敏度、准确性可满足法医单细胞检验的要求。另外一种最新的方法也值得关注，是在微液滴里进行pCR扩增。首先将单个细胞和荧光标记引物结合的微珠随机扩散在1.5nL的油包裹的琼脂微流液滴中，在大量微液滴内进行平行的pCR扩增反应后，于pCR扩增管内进行二次扩增，常规毛细管电泳检测，通过对大量单个细胞进行平行9重StR检测，获得混合样本各成分的StR分型。
4数据分析
单细胞检验由于Dna模板量非常低，其缺带、多带等现象经常发生，stutter峰较常规扩增强，单细胞检验的数据分析和低拷贝Dna的分析方法类似，需平行扩增，综合多次结果获得最终的StR分型。一般来说至少需获得5次有效分型（获得13个基因座以上的结果）[28]，重复3次及以上的位点才能确认为有效位点。
5单细胞测序
在二代测序技术和全基因组扩增技术（wholegenomeamplification,wGa）发展的基础上，2011年，navin等人首次发明了单细胞测序（single-cellsequencing,SCS）技术，测定了人体单个细胞的基因组Dna。单细胞测序的文章呈逐年递增状态，从2011～2014年，由5篇文章上升至近30篇，涉及生物学多个领域，发表于生物学顶级期刊上。2013年《，科学》杂志将单细胞测序列为年度领域榜首《，自然方法》杂志将单细胞测序列为2013年年度最重要的方法学进展。
5.1全基因组扩增技术由于单个细胞Dna含量有限，需进行全基因组扩增才能满足二代测序的最低Dna量。目前，已有多种以单个基因组为模板的全基因扩增技术，简称寡核苷酸引物pCR技术（degenerateoligonucleotideprimedpCR,Dop-pCR）和多重置换扩增技术（multipledisplacementamplification,mDa）。其中Dop-pCR方法覆盖率低，但可获得准确的拷贝数。mDa方法是在恒温下利用具有强模板结合的phi29Dna聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。phi29Dna聚合酶具有3’5’外切酶活性，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性，产生的Dn段较大，约为50~100kb，可以覆盖基因组的90%以上，和Dop-pCR方法一样也会产生不同区域扩增不平衡性，mDa方法产生的不平衡性不具有重复性。2012年，首次报道了基于多次退火环状循环的扩增技术（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,maLBaC），该方法结合mDa扩增技术和pCR扩增技术的优势，利用特殊设计的引物，巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环，进而在一定程度上防止了基因组Dna的指数性扩增，明显降低了扩增偏倚性，并显著提高覆盖度，但是该方法使用Bst聚合酶，没有校错活性（proofreadingactivity）。现有的商业化试剂盒各项参数见表1。全基因组扩增技术虽然仍然会有基因缺失等问题，但是相信随着时间的推移和技术的进步，扩增的准确性会逐步提高。
5.2二代测序技术对单细胞全基因组扩增后进行二代测序。二代测序技术具有快速、高效、低成本的优点。近两年来的研究表明，二代测序结果的准确性很高，与传统的Sanger测序相当。二代测序技术在法医学中应用研究很多，目前已经有两种商业化的试剂盒，美国thermoFisherScientific公司开发的基于Snp的theHiD-ionampliSeqtmidentitypanel和theHiD-ionampliSeqtmancestrypanel，主要通过Snp检测进行个体识别和祖先推断；美国illumina公司开发的ForenSeqtmDnaSignatureprepKit，在一个pCR反应中可以同时扩增27个常染色体StR，8个X-StR，25个Y-StR，95个个体识别Snps，56个祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,aims)和24个显性特征Snps，更适合法医学应用。这两个公司使用的测序技术的优缺点见表2。
6单细胞检验展望
细胞生物学的技术篇8
1839年。德国植物学家施莱登和动物学家施旺共同创立了划时代的细胞学说，并被恩格斯誉为“19世纪自然科学的三大发现”之一。根据细胞学说的理论，当时有人提出，可以将不同植物或不同动物的细胞相互合并，创造出新的植物或新的动物。在当时的科学背景下，这只是科学幻想而已。随着细胞工程技术的崛起。它已成了现实。
细胞工程是细胞融合技术和组织培养等生物工程技术的统一。其中，细胞融合技术是细胞工程的主要支柱。细胞融合技术，就是利用一定条件使细胞质和细胞壁(或细胞膜)发生变化，使不同植物或不同动物的细胞相互合并的一项技术。细胞工程已创造了不少奇迹。如科学家成功地使山羊和绵羊的细胞互相融合，培养出一种头和尾象山羊、躯体像绵羊的“山绵羊”。再如，科学家已巧妙地使马铃薯和西红柿的细胞融合，培育出新的植物“土豆西红柿”。这种植物根部长出马铃薯，枝头结满西红柿，这种西红柿，还保留了两者都具有的抗病能力。
事实表明，细胞工程技术完全能培育出地球上从来没有过的动植物。科学家们宣称：人类已进入创造新的生命形态的时代。我们面前将会出现一个人工创造的新的生命世界，但这也可能带来一种可怕的事实一一出现人工制造的“新人种”!这并非故作惊人之语，美国社会学家史塔伯福特和物理学隶兰德指出：不久的将来，会有八类“新人种”出现!据预测，最早诞生的“新人种”有3种：一、“鱼人”――专为水底工作而设计%b