牛血清白蛋白篇1
【关键词】对苯二酚
蛋白质是生物体的基本组成成分，如酶、抗体、转运蛋白等在生物体内发挥着重要功能。人血清白蛋白存在于血液中，分子量为66241，等电点为47〔1〕，主要维持血浆的胶体渗透压，其另一功能是与许多微溶于水的物质结合为易溶于水的复合物。酚类化合物对Dna有不同程度的损害〔2-5〕，对苯二酚在环境中容易氧化为对苯二醌，对苯二酚与对苯二醌可以和Dna碱基形成加合物〔6-8〕，对人体危害极大。对苯二酚与对苯二醌是通过人血清白蛋白转运进入人体各器官。因此，研究血清白蛋白与对苯二酚与对苯二醌的相互作用具有重要意义。本文利用循环伏安法研究了对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为，并初步探讨了在L半胱氨酸上牛血清白蛋白与对苯二酚及对苯二醌相互作用的机制。
1材料与方法
11仪器与试剂缓冲液：005mol/Lna2Hpo4-005mol/LnaH2po4-010mol/LnaCl缓冲溶液(用naoH调pH)；005g/LL半胱氨酸；01mol/LH2So4；20000g/L对苯二酚。200000g/L牛血清白蛋白。meC-12B型多功能微机电化学分析仪(江苏电分析仪器厂)；金电极(直径1mm)为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
12实验方法
121L半胱氨酸在金电极上组装将金电极在置于005μmal2o3粉末中反复抛光至镜面，用microcloth抛光布抛光光亮，再用丙酮冲洗，用亚沸水超声波清洗。将金电极置于01mol/LH2So4中于2V氧化5s，-035～15V于1V/s循环扫描5次，取出金电极，用蒸馏水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min，将清洁后的金电极置于50g/LL半胱氨酸浸泡24h，取出金电极，用蒸馏水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min，即得L半胱氨酸修饰金电极。所用水为3次亚沸蒸馏水。
122电化学行为在500ml容量瓶中，加入010ml对苯二酚，500ml005mol/Lna2Hpo4-015mol/LnaCl缓冲溶液，混匀，作循环伏安扫描。
13量子化学计算对苯二酚与对苯二醌用半经验方法(am1)进行分子几何构型初始优化，然后用密度泛函理论(DFt)在6-31G(d)水平进行全优化分子结构，在相同水平计算分子的分子前线轨道能量及静电荷。用Gaussian03软件完成所有计算。
2结果
21L半胱氨酸修饰电极的电化学行为特征(图1)由修饰电极于-060～08V范围内的循环伏安图可见，裸金电极上未见氧化还原峰存在；L半胱氨酸修饰电极在高电位的电流增大，溶液pH=730时，在-0068V产生一个氧化峰，这可能是羧基在较低的电位下被还原为羟基所致。
22对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为(图2，表1)从表1可见，在L半胱氨酸修饰金电极上，当溶液pH=730时，氧化峰(epa)比裸金电极负移了0169V，还原峰(epc)比裸金电极负移了0061V，对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极可逆性变好，峰电流变大，对对苯二酚的氧化还原具有催化作用。结果与杜丹等人研究对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为一致〔9〕。当溶液pH=1100时，在L胱氨酸修饰金电极上的氧化峰比裸金电极正移了0090V，还原峰比裸金电极负移了0010V，说明在pH-1100时，对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极可逆性变坏，峰电流变小，对对苯二酚的氧化还原不具有催化作用。
表1对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极及裸金电极上的电化学参数（略）
23扫速对对苯二酚峰电流和峰电位的影响对苯二酚在裸金电极上的氧化还原峰电位随着扫速的增大氧化峰电位发生正移，还原峰负移，峰电流(ip)与扫速的平方根(V1/2)成正比，说明峰电流受扩散控制；对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的氧化还原峰电位受扫速的影响与裸金电极相似，峰电流(ip)与扫速的平方根(V1/2)成正比，说明峰电流也受扩散控制。
a，a`:裸金电极；b，b`:L半胱氨酸修饰电极；扫描速度：100mv/s
图1L半胱氨酸修饰金电极上的循环伏安图（略）
a，a`:00400g/L对苯二酚在裸金电极上；b，b`:00400g/L对苯二酚在L半胱氨酸修饰电极上；扫描速度：100mv/s
图2对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上和裸金电极上的循环伏安图（略）
24牛血清白蛋白对峰电位与电流的影响(图3)由于牛血清白蛋白容易吸附到金电极上，故在修饰电极上研究了牛血清白蛋白在pH=730溶液中对对苯二酚氧化还原电位及电流的影响。从图3可见，牛血清白蛋白加入到对苯二酚溶液时，其氧化峰电位发生负移，但峰电流改变不大，说明牛血清白蛋白对对苯二酚向电极扩散的影响较小；而对其氧化产物对苯二醌，其氧化峰电位发生负移，峰电流变小，说明牛血清白蛋白对对苯二醌的扩散的影响较大。当牛血清白蛋白的浓度达到05000g/L时，峰电位不再改变，说明牛血清白蛋白与对苯二酚结合达到饱和状态。当牛血清白蛋白的浓度达到12000g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与对苯二醌结合达到饱和状态。根据苯二酚和对苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量，计算苯二酚和对苯二醌和血清白蛋白结合比分别为48：1和16：1。
转贴于
a:00400g/L对苯二酚;b:00400g/L(15800g/L)牛血清白蛋白；pH=730；扫描速度：100mv/s
图3牛血清白蛋白对苯二氧化还原电位及电流的影响（略）
25对苯二酚现对苯二醌的量子化学计算结果对苯二酚与对苯二醌所有原子都在一个平面内，对苯二醌的最大净电荷为043，最小的负电荷为-045，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为-012999和-027059Hartree，分子的偶极距为0，为非极性分子；分子的净电荷反映了分子间净电吸引的能力；最低空轨道能量越低，越容易接受电子，最高占有轨道能量越高越容易提供电子，分子的前线轨道反映了形成分子氢键的能力，故对苯二酚较对苯二醌容易提供电子，而对苯二醌较对苯二酚容易接受电子。由此来看，对苯二醌比对苯二酚具有较大的净电吸引的能力和形成分子氢键的能力，因而在电极上峰电位和峰电流改变较大。
3讨论
结果表明，在pH1100时主要以nH2-C(R)oo存在。具有较好催化活性的基团为nH3-C(R)oo-。苯酚的pKa1=1000时，主要以苯酚分子的形式存在，而对苯二酚的羟基是供电子基团，故pKa1
参考文献
〔1〕张昌颖.生物化学［m］.2版.北京：人民卫生出版社，1985：432.
〔2〕宋远志.对苯二酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2006，22(2)：192-194.
〔3〕宋远志.苯酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21(12)：113-114.
〔4〕宋远志.对硝基苯酚与杂交中Dna的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21(1)：33-35.
〔5〕宋远志.邻氨基酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21(9)：94-96.
〔6〕Krisztinapongracz，williamJ.Bodell.Detectionof3'-Hydroxy-1，n6-benzetheno-2'-deoxyadenosine3'phosphateby32ppostlabelingofDnaReactedwithpBenzoquinone［J］.ChemRestoxicol，1991，4:199-202.
〔7〕margaretGaskell，RebekahJukes，DonaldJ.L.Jones.identificationandCharacterizationof(3，4-Dihydroxy)-1，n2-benzetheno-2-deoxyguanosine3-monophosphate，anovelDnaadductFormedbyBenzenemetabolites［J］.ChemRestoxicol，2002，15:1088-1095.
〔8〕margaretGaskell，KeithiemcLuckie，peterB.Farmer.Genotoxicityofthebenzenemetabolitespara-benzoquinoneandhydroquinone［J］.Chemico-Biologicalinteractions，2005，153(1):267-270.
牛血清白蛋白篇2
[关键词]牛血清白蛋白；生物色谱柱；阿司匹林
[中图分类号]R96[文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2014）06（a）-0101-04
preparationofbovineserumalbuminbiologicalchromatographiccolumnanditsapplicationindeterminationofaspirin
tanGLingli1weiShibai2HUanGDongping1HUanGmingli1RUanChong1
1.CollegeofpublicHealthofGuangximedicalUniversity,GuangxiZhuangautonomousRegion,nanning530021,China;2.Departmentofpharmacy,theFirstaffiliatedHospitalofGuangximedicalUniversity,GuangxiZhuangautonomousRegion,nanning530021,China
[abstract]objectivetopreparebiologicalchromatographiccolumntoseparateanddeterminetheingredientsofdrugs.methodsSilicagelwasreactedwith3-aminopropyltrimethoxylsilanetoformaminefunctionalizedactivatedsilicagel,whichwascovalentbindingwithBSatosynthesizeBSabondedstationaryphase.thenBSabondedstationaryphasewaspackedcolumnwithhomogenization,thusBSabiologicalchromatographiccolumnwasprepared.aspirinwastakenasadetectiveobjecttoexaminethecombinationperformanceandseparationperformanceofBSabondedstationaryphase.Resultsitcametothat,thecombinedratewas3.69μmol/g,thebiologicalchromatographiccolumnwas74mg/g,theamountofaspirininpertabletwas14.65μgandthelabeledamountwas107.8%detectedbyBSabiologicalchromatographiccolumn.ConclusionallofaboveshowsthatBSabondedstationaryphaseissynthesizedsuccessfully,andtheBSabiologicalchromatographiccolumnhasgoodcombinationpropertyandseparationproperty.
[Keywords]Bovineserumalbumin;Biologicalchromatographiccolumn;aspirin
牛血清白蛋白色谱柱的制备
及对阿司匹林的
1.广西医科大学公共卫生学院，广西南宁530021；2.广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁530021
[摘要]目的制备生物色谱柱，用于分离或测定药物成分。方法采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（aptS）与硅胶反应生成氨基功能化的活化硅胶，并与牛血清蛋白（BSa）共价结合形成BSa键合固定相，匀浆装柱制备成BSa生物色谱柱，以阿司匹林（aspirin，aSp）为分析对象考察BSa固定相的结合性能和分离性能。结果BSa结合率为3.69μmol/g，aSp在BSa键合固定相色谱柱上的最大结合量为74mg/g，经BSa色谱柱测得阿司匹林肠溶片的含量为14.65μg/片，标示量为107.8%。结论这表明BSa与硅胶载体成功结合形成BSa键合固定相，所制备的BSa生物色谱柱具有良好的结合性能与分离性能。
[关键词]牛血清白蛋白；生物色谱柱；阿司匹林
[中图分类号]R96[文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2014）06（a）-0101-04
preparationofbovineserumalbuminbiologicalchromatographiccolumnanditsapplicationindeterminationofaspirin
tanGLingli1weiShibai2HUanGDongping1HUanGmingli1RUanChong1
1.CollegeofpublicHealthofGuangximedicalUniversity,GuangxiZhuangautonomousRegion,nanning530021,China;2.Departmentofpharmacy,theFirstaffiliatedHospitalofGuangximedicalUniversity,GuangxiZhuangautonomousRegion,nanning530021,China
[abstract]objectivetopreparebiologicalchromatographiccolumntoseparateanddeterminetheingredientsofdrugs.methodsSilicagelwasreactedwith3-aminopropyltrimethoxylsilanetoformaminefunctionalizedactivatedsilicagel,whichwascovalentbindingwithBSatosynthesizeBSabondedstationaryphase.thenBSabondedstationaryphasewaspackedcolumnwithhomogenization,thusBSabiologicalchromatographiccolumnwasprepared.aspirinwastakenasadetectiveobjecttoexaminethecombinationperformanceandseparationperformanceofBSabondedstationaryphase.Resultsitcametothat,thecombinedratewas3.69μmol/g,thebiologicalchromatographiccolumnwas74mg/g,theamountofaspirininpertabletwas14.65μgandthelabeledamountwas107.8%detectedbyBSabiologicalchromatographiccolumn.ConclusionallofaboveshowsthatBSabondedstationaryphaseissynthesizedsuccessfully,andtheBSabiologicalchromatographiccolumnhasgoodcombinationpropertyandseparationproperty.
[Keywords]Bovineserumalbumin;Biologicalchromatographiccolumn;aspirin分子生物色谱法（mBC）是20世纪80年代中后期逐渐发展起来的以酶、受体、抗体、传输蛋白等生物大分子为固定相的一类色谱法，是基于生物大分子的特异性相互作用原理进行分离纯化具有活性的化合物或测定生化参数的一项新兴技术[1]。药物作为一类重要的生物活性物质与血浆蛋白存在可逆性的结合平衡，药物分子通过血浆白蛋白的运输到达受体部位发生药理作用，而药物分子在体内与血浆蛋白的相互作用是其发挥药理作用的前提，因此可以通过血浆白蛋白生物色谱筛选药物中的活性成分。付强等[2]通过自制人血清白蛋白色谱柱成功对DL（±）色氨酸进行了手性分离；Bentucci等[3]制备出的血清白蛋白色谱柱，不仅可筛选出药物活性成分，还可通过体外实验反映药物-血清白蛋白的相互作用。蔡汉宁等[4]制备出核心组蛋白色谱柱作用于其活性物质，至少筛选出9种组蛋白作用蛋白。与传统的实验方法相比，分子生物色谱法具有高度专一性、分离速度更快、容易自动化操作、重复性好等优点[5]。
由于人血清白蛋白价格昂贵，用于制备生物色谱柱成本太高，有学者利用牛血清白蛋白与人血清白蛋白结构相似的特点，制备成牛血清白蛋白色谱柱用于中药活性成分的分离测定。tan等[6]通过制备的牛血清蛋白生物整体柱，成功的分离出当归的活性成分，并考察了当归提取液在该整体柱上保留的影响。本文主要通过将硅胶氨基功能化与BSa共价键结合合成BSa固定相，制备BSa生物色谱柱，并选择了阿司匹林（aSp）作为与BSa结合的对象来验证BSa色谱柱的性能。aSp作为一种代表性药物，不仅具有卓越的消炎、退热、止痛能力，研究表明它还可以协同干扰素抑制肝细胞癌生长转移[7]，抑制宫颈癌Hela细胞增殖[8]，预防妊娠期高血压[9]等。通过对aSp及其肠溶片的分离测定，可以进一步探讨生物色谱柱在药物有效成分分离测定中的应用前景。
1仪器与材料
6010紫外可见分光度计（安捷伦科技公司，上海）；LC-10tvp高效液相色谱仪（日本岛津公司）；spectrum100傅立叶变换红外光谱仪（美国penkimelmer仪器有限公司）；Bio-Rad垂直电泳槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司）。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷（aptS）（97%，上海晶纯试剂有限公司，批号：15122）；n，n′-琥珀酰亚胺碳酸酯（98%，阿拉丁公司，批号：25231）；考马斯亮蓝G250（沃凯，批号：wB20091102）；BSa（Solarbio）；硅胶SepraSilica（粒径50μm，phenomenex美国）；aSp标准品（purity>99%）；aSp肠溶片（50mg/片，国药准字H43021814）；四甲基乙二胺（temeD）、丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、tris碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）均来自北京索莱宝。
2方法与结果
2.1BSa色谱柱的制备
取硅胶2g（平均粒径为50μm，孔径46Å（1Å=0.1nm），比表面积为518m2/g），加入适量甲苯回流除去残留水分，按10μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反应8h得到氨丙基硅胶，过滤，分别用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅胶2g，加入乙腈5mL和n，n′-琥珀酰亚胺碳酸酯2g，于30℃反应24h，过滤后分别用乙腈、甲醇洗涤得到活化硅胶。取制备得的活性硅胶1.5g，加入到25mmol/L（pH=6.6）的磷酸盐缓冲液中，再加入适量BSa，30℃下搅拌反应20h，过滤后依次用水及5%乙醇多次洗涤，得到BSa固定相。将制备好的BSa固定相用缓冲液匀浆后注入不锈钢柱（4.5nm×150nm）中，并抽真空压紧柱，制备得到BSa色谱柱。
2.2傅里叶红外光谱（FtiR）验证活化硅胶功能基团
用溴化钾压片法制备活化硅胶样品，进行FtiR分析。FtiR分析结果见图1，硅胶（a）和活化硅胶（b）共有的吸收峰有：1099、1103cm-1处的非对称伸缩振动，指纹区800cm-1的对称伸缩振动和470cm-1的弯曲振动，均为硅胶的主要结构Si-o的特征谱带；与硅胶（a）相比，活化硅胶（b）增加了伯胺（-nH2）的吸收峰1402、1561cm-1，2928cm-1峰为亚甲基的不对称变形振动峰，说明硅胶上中有亚甲基的存在，表明aptS已结合在硅胶上。由此可见，活化硅胶成功连接上了氨基功能基团。
a.硅胶；b.活化硅胶
图1硅胶和活化硅胶的红外光谱图
2.3BSa与活化硅胶结合量
按硅胶与BSa质量比8∶1、4∶1、2∶1、1∶1进行表面覆盖率的测定。称取四份硅胶，每份0.5000g，分别与0.0625、0.1251、0.2500、0.5000gBSa反应，反应结束后各取100μL洗涤液采用考马斯亮蓝染色法[10]测定其中BSa含量，用BSa加入量与反应剩余BSa量之差计算出结合量，按照下列公式计算出BSa的表面覆盖率：表面覆盖率=结合蛋白的物质的量（μmol）/活化硅胶质量（g）。结果显示，活化硅胶与BSa质量比为4∶1时，BSa结合量已基本达到饱和，加大剂量并不能明显的增加键合量，表明BSa表面覆盖率可能受空间位阻大小的影响。见图2。
图2活化硅胶与BSa不同配比下的BSa表面覆盖率
2.4BSa固定相结合aSp研究
精密称取aSp对照品50mg，用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀释至50mL，摇匀，得到aSp标准溶液。取aSp标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀释至10mL，各取10μL用于HpLC。色谱条件：流动相：甲醇-20%冰醋酸（3∶1）；流速：1mL/min；色谱柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；紫外检测器，λ=237nm。得到aSp标准曲线方程：Y=97941X+37178，r=0.9997，其中Y为峰面积，X为aSp浓度（μg/μL）。
称取一定量的硅胶和BSa固定相匀浆法分别填装于两根柱子中，精密称定适量的aSp，用中性乙醇溶解后缓缓倾注入色谱柱中，用蒸馏水洗涤柱子，接收洗涤液，根据标准曲线计算洗脱液中aSp含量，aSp加入量与洗脱液中aSp含量之差得到固定相对aSp的结合量，见图3。对比硅胶固定相和BSa固定相对aSp的结合量，aSp与BSa固定相结合量明显大于与硅胶固定相结合量，证明与aSp结合的主要是BSa而不是硅胶。
图3硅胶固定相、BSa固定相与阿司匹林结合量的比较
2.5BSa色谱柱性能考察
牛血清白蛋白篇3
[摘要]目的探讨小牛血清去蛋白提取物对放射性肠炎的防治作用，寻找能够有效防治各种放射性黏膜损伤的理想药物。方法将Ⅱ、Ⅲ期盆腔肿瘤患者108例随机分成观察组和对照组各54例，观察组行放疗+小牛血清去蛋白提取物保留灌肠，对照组行放疗+地塞米松等药物保留灌肠，观察两组相关血清和临床指标在治疗前后的变化。结果在疗程内，随着时间的推移，C反应蛋白（CRp）的水平不断升高，观察组的CRp增长速度慢于对照组（p<0.05）；与对照组相比，观察组能显著延长首次直肠临床症状的发生时间；放疗结束后，观察组总有效率为81.48%，显著高于对照组的59.26%，差异具有统计学意义（p<0.05）。结论小牛血清去蛋白提取物可有效调节CRp水平，减轻放疗所致的直肠黏膜免疫损伤，推迟直肠黏膜炎症的发生时间。
[关键词]盆腔肿瘤；小牛血清去蛋白提取物；放射性肠炎；C-反应蛋白
[中图分类号]R574[文献标识码]B[文章编号]2095-0616（2013）16-15-03
盆腔、腹腔、腹膜后肿瘤，尤其是妇科肿瘤及前列腺肿瘤是最常见的恶性肿瘤，放射治疗已经成为恶性肿瘤综合治疗过程中一个不可缺少的重要环节。但放疗中常常出现累及小肠、结肠和直肠的放射性肠炎（radiationenteritis，Re）。据流行病学不完全统计，目前我国放射性肠炎发生率高达7%～21%[1]，常表现为腹痛、腹泻、大便次数增多、便脓、便血，严重者可出现肠粘连、肠狭窄、肠梗阻。放射性肠炎不仅给患者带来不便和痛苦，同时还会导致放疗计划不能顺利进行进而影响治疗效果[2]，因此，如何防治放射性肠炎已经成为医生和患者急需解决的关键问题。小牛血清去蛋白提取物能有效防治放射所致的皮肤黏膜损伤，在放射性口腔黏膜炎防治上已得到广泛的应用[3]，然而对于放射性肠炎的临床应用报道较少，本研究采用随机对照研究法来评价小牛血清去蛋白提取物保留灌肠治疗放射性肠炎疗效，同时寻找一种能预测疗效的生化指标。
1资料与方法
1.1一般资料
选择2010年12月～2012年12月间我院肿瘤科门诊及住院进行放射治疗的盆腔肿瘤患者108例，所有患者经X线钡剂检查、肠系膜血管造影、内窥镜检查、活组织检查以及病理证实、无远处转移及影响放疗的严重内科疾病、卡氏评分>70，并签署了相关治疗知情同意书。所有患者随机分为观察组和对照组各54例，观察组男15例，女39例，年龄37～72岁，平均（50.1±13.2）岁，体重51～82kg，平均（67.1±18.5）kg；病理类型：宫颈癌20例、卵巢癌13例、直肠癌10例、膀胱癌7例、前列腺癌4例；采用放射损伤分级标准对放射性肠炎进行分级：Ⅱ度放射性肠炎32例，Ⅲ度放射性肠炎22例。对照组男17例，女37例，年龄40～75岁，平均（48.0±16.0）岁，体重47～78kg，平均（63.3±15.2）kg；病理类型：宫颈癌18例、直肠癌13例、卵巢癌12例、膀胱癌6例、前列腺癌5例；Ⅱ度放射性肠炎30例，Ⅲ度放射性肠炎24例。所有患者均为术后单纯放射治疗，两组患者在年龄、性别、体重指数、病理类型以及放射性肠炎分级等方面比较，差异无统计学意义（p>0.05），具有可比性。
1.2治疗方法
从放疗疗程开始第1天，观察组应用小牛血清去蛋白提取物（黑龙江省珍宝岛制药有限公司，H20013157），给药方式为：生理盐水50mL+小牛血清去蛋白提取物200mg，保留灌肠，1次/d，5次/周。对照组给药方式为：生理盐水50mL+庆大霉素8mg+地塞米松5mg+维生素B121mg，保留灌肠。一般用药时间在当日放疗结束后1h内给药，至常规放射治疗结束后1周为止。
1.3观察指标及疗效评价
两组患者于放疗前1天开始抽静脉血送检血清C反应蛋白，之后每放疗5次抽1次静脉血，持续至放疗疗程结束。采用美国BD公司生产的凝血检测专用真空采血管采集者放疗后1h左右的静脉血3mL置于含枸橼酸钠抗凝管中，3000r/min，离心15min，制备的血浆严格按操作规程定量检测CRp，跟踪观察患者病情，对照组采用相同方法采集静脉血3mL。CRp检测采用免疫散射比浊法，采用美国贝克曼库尔特有限公司生产的贝克曼aCL7000全自动血凝仪上进行，采用配套的增强型乳胶免疫分析定量检测试剂盒，定标血浆由美国贝克曼公司提供。
放疗结束后，依据RtoG/eoRtC小肠/大肠晚期放射性损伤分级方案[4]：0级，无明显肠道症状；Ⅰ级，轻度腹泻，轻度痉挛，轻度直肠分泌物增多或出血；Ⅱ级，中度腹泻和肠绞痛，大便>5次/日，多量直肠黏液或间断出血；Ⅲ级，梗阻或出血，需手术；Ⅳ级，发生坏死、穿孔、瘘道。
放疗评定标准[5]：治愈（CR）：分级下降至0级；部分缓解（pR）：分级下降但未达到0级；无效（nC）：分级无下降，甚至上升。有效率为CR+pR。
1.4统计学处理
采用SpSS13.0软件进行数据统计分析。计量资料以（）表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组患者C反应蛋白与放疗疗程的关系
2.2两组临床疗效比较
治疗前后两组各级放射性直肠炎的分布见表2，观察组中30例患者分级由Ⅰ级下降到0级，治愈率为55.56%（30/54）；14例患者分级由Ⅱ级下降到Ⅰ级，部分缓解率为25.92%（14/54）；10例患者分级无下降，无效率为18.52%（10/54）；总有效率为81.48%（44/54）。对照组中21例患者分级由Ⅰ级下降到0级，治愈率为38.89%（21/54）；11例患者分级由Ⅱ级下降到Ⅰ级，部分缓解率为20.37%（11/54）；16例患者分级无下降，6例患者分级下降到Ⅲ级，无效率为40.74%（22/54）；总有效率为59.26%（32/54）。总有效率组间比较差异有统计学意义（p<0.05）。观察组患者首次出现放射性直肠炎时间为（18.0±4.0）d，剂量为（28.0±7.0）Gy；对照组患者首次出现放射性直肠炎时间为（12.0±3.0）d，剂量为（19.0±5.0）Gy，提示观察组推迟了放射性直肠炎发生时间并缩短了临床症状持续时间（t=4.218，p<0.05）。
牛血清白蛋白篇4
[关键词] 荧光光谱法；分光光度法；盐酸拓扑替康；盐酸依利替康；喜树碱类药物；牛血清白蛋白；结合反应
喜树碱是采用特殊工艺从植物中提取而得的，来源于我国特有珙桐科植物喜树，是一种具有很强抗癌活性的天然化合物[1]。蛋白质是最重要的生物大分子之一，几乎参与了所有生命活动过程。本研究采用荧光光谱法、分光光度法对蛋白质与盐酸拓扑替康（tHC）与盐酸依利替康（iHC）两种喜树碱类药物有机小分子的相互作用机理进行研究，为高效低毒的喜树碱类药物开发提供参考。
1 实验方法
1.1检验设备
CaRYeclipse型荧光光度计（瓦里安）；3400型uv—vjs分光光度计（日立）。
1.2实验方法
1.2.1荧光光谱法[2]
在10ml比色管中加入0.2ml牛血清白蛋白（含量lmg/ml），依次加入1×10-4mol/l盐酸拓扑替康溶液适量，0.5mlpH为7.4的tris-HCl缓冲溶液，用荧光光度计以1cm石英比色皿测定荧光强度。然后分别加入KCl、CaCL2、ZnCl2、FeCL3、CuCl2溶液测定金属离子对喜树碱类药物猝灭Bsa荧光的影响.
1.2.2分光光度法[3]
在10ml比色管中加入lml1×10-4mol/l盐酸拓扑替康溶液，加入0.5mlpH为7.4的tris-HCl缓冲溶液，在分光光度计上进行吸光度测定。盐酸依利替康测定方法同上。
2 结果
2.1荧光光谱
牛血清自蛋白分子中因含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等残基而发射较强的内源荧光。用盐酸拓扑替康与盐酸依利替康两种喜树碱类药物滴定牛血清自蛋白，测定结果显示350nm处的荧光发射峰被猝灭，而在450nm、540nm二处出现了新的发射峰，即盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的发射峰，二种分子在405nm处有一等发射点，荧光光谱结果提示牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康之间发生了静态猝灭作用，二者结合生成了超分子化合物，405nm处的等发射点说明溶液中同时存在着被结合的和游离的盐酸拓扑替康与盐酸依利替康，从荧光光谱图中显示，仅盐酸拓扑替康与盐酸依利替康比有牛血清自蛋白存在下盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的最大吸收峰强度要弱，充分说明牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康之间发生了非辐射荧光共振能量转移，且牛血清自蛋白对盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的荧光吸收有敏化作用。
2.2分光光度
牛血清自蛋白加入盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的紫外可见吸收光谱。随着盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的加入，在278nm处的牛血清自蛋白吸收峰逐渐升高并伴有轻微的蓝移，结果与荧光光谱相符，结果提示牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康相互作用引起了蛋白质分子发生了变化，短波方向移动说明蛋白质分子的肽链延伸了并且疏水性下降。
3 讨论
人血清白蛋白（HSa）与牛血清白蛋白（BSa）具有相似的氨基酸序列，人血清白蛋白是由585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量为67kDa；而牛血清白蛋白是由580个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量为68kDa。肽链中都含有35个半胱氨酸残基。因此，在药物研究中，牛血清白蛋白常替代人血清白蛋白来作为蛋白质模型进行体外研究，作为与人血清白蛋白结合情况的参考，且价廉易得，而人血清白蛋白主要用于遗传方面、临床、新陈代谢的研究。
本研究采用荧光光谱法、分光光度法研究盐酸拓扑替康与盐酸依利替康两种喜树碱类药物与牛血清白蛋白的相互结台反应结果显示，牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康之间发生了静态猝灭作用，二者结合生成了超分子化合物。牛血清白蛋白与二种喜树碱类药物之间存在的相关性，可引起了蛋白质分子的变化。
参考文献：
[1]李桂芝，刘永明，虢新运，等.荧光法研究7-乙基喜树碱、l0-羟基喜树碱和牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化学，2006，34（9）：91-94.
牛血清白蛋白篇5
[关键词]牛奶蛋白过敏；婴儿；腹泻病；氨基酸配方粉
[中图分类号]R725.7[文献标识码]B[文章编号]1673-9701（2012）31-0131-02
牛奶蛋白过敏是小儿最常见的食物过敏之一，在欧美发达国家，婴儿牛奶过敏发生率达2.0%～7.5%[1]。近年来，随着临床医学发展及人们生活水平提高，儿科医师越来越关注牛奶蛋白过敏与婴儿腹泻病的关系。本文对近两年来我科住院及门诊由牛奶蛋白过敏所致婴儿腹泻病20例患者的临床资料进行分析总结。
1对象与方法
1.1对象
2010年2月～2012年2月在我院门诊及住院20例1～6个月婴儿，其中男15例，女5例，全部满足下例条件：①主要症状除反复腹泻外，部分伴脓血便、呕吐、湿疹；②肠镜提示肠黏膜有灶性红斑、小结节、糜烂甚至溃疡等不同病理改变；③食物特异性免疫球蛋白G检测一种或多种蛋白不耐受；④食物回避试验或激发试验阳性；⑤辅食添加至蛋清/蛋黄、鳕鱼、牛肉、鸡肉、小麦、西红柿、大米中的3～4种。
1.2方法
采集患儿喂养史、家族过敏史及临床表现，对20例1～6个月婴儿进行血细胞分析、凝血系列、肝功能、便常规及培养、肠镜检查、食物特异性免疫球蛋白G检测。
2结果
2.1过敏情况及喂养情况
20例患儿5例皮肤湿疹，2例家长患有过敏性疾病，15例配方奶粉喂养，3例母乳+配方奶粉混合喂养。
2.2临床表现
生后由于母乳不足，给予添加配方奶粉喂养后，出现腹泻、脓血便、呕吐、湿疹等。发病时间大多为生后1～3个月，临床上均以反复腹泻伴/不伴脓血便为主要临床表现，既往诊断急性腹泻病或急性感染性腹泻病，予抗感染、补液、止泻等对症治疗后，大便呈黄色糊状，无肉眼脓血便及镜下血便，每日1～2次，不久再次发作。其中5例伴有皮肤湿疹，大部分湿疹见于颜面部、颈部、两耳廓及四肢褶皱处，临床表现为瘙痒，部分可渗出、结痂，皮肤科予外用药局部治疗后好转，但经常复发。2例患儿家长有过敏性鼻炎病史。
2.3辅助检查
2.3.1血细胞分析检查20例白细胞计数均正常，其中嗜酸性粒细胞升高14例，贫血5例，血红蛋白（95～105）g/L。
2.3.2便常规检查及便培养检查便常规检查：白细胞++～+++/HpF，潜血试验阳性12例；白细胞+/HpF，潜血试验阴性5例；白细胞（3～5）/HpF，潜血试验阴性3例；20例便培养均为培养出致病菌。
2.3.3凝血系列、肝功能检查20例患儿化验凝血系列、肝功能均正常。
2.3.4肠镜检查结果20例全部行电子肠镜检，15例肠黏膜灶性红斑、小结节、糜烂甚至溃疡；5例肠黏膜无明显改变。见图1。
2.3.5食物特异性免疫球蛋白G检测采用食物特异性免疫球蛋白G抗体检测试剂盒（美国BiomeRiCa公司出品的allerqua-nttmFoodigGeLiSaKit），酶联免疫法检测20例患儿对牛奶、鱼、虾、大豆、花生、蛋黄/蛋清、牛肉、鸡肉、西红柿、小麦、鳕鱼、玉米、大米等14种食物的敏感性；结果判定在全自动酶标仪450mm波长处测定每孔吸光度a值，通过与标准曲线比较得到igG浓度（nakt/L）。食物特异性免疫球蛋白G判断标准：0级为阴性，+1级为轻度不耐受，+2级为中度不耐受，+3级为重度不耐受，20例患儿检测结果示：15例仅牛奶+3；3例牛奶+3，蛋黄/蛋清+1；2例牛奶+2，鳕鱼+1。
2.3.6食物回避试验或激发试验食物过敏的最好治疗是回避不适宜食物，而激发试验则是诊断食物过敏的“金标准”[2]。所有患儿在未给予特殊药物治疗前，回避原有配方奶粉、母乳喂养及添加辅食，更换为氨基酸配方粉（商品名纽康特），其中12例在1周临床症状明显好转，粪便转为黄色糊状，复查便常规白细胞（0～3）/HpF，潜血试验阴性；5例3d复查便常规白细胞阴性，潜血试验阴性；湿疹患儿2周内湿疹完全消退。本研究随访3个月以上患儿15例，其中12例服用氨基酸配方粉3个月后替换为普通配方奶及添加辅食半年内无临床症状，其余3例停用氨基酸配方粉后再次出现腹泻、脓血便，呕吐及颜面部湿疹，更换为氨基酸配方粉后不久临床症状消失，表明小儿腹泻病与牛奶蛋白过敏密切相关。
3讨论
婴儿是食物过敏的高危人群，其中以牛奶蛋白过敏最多见。牛奶蛋白过敏是指机体牛奶蛋白的高反应性，可涉及多器官和多系统，表现为皮肤、胃肠道和呼吸道症状[3]，临床可分为ige介导型和非ige介导型，前者表现为皮肤搔痒、荨麻疹、血管性水肿、喘息发作、鼻炎、呕吐、腹泻等，常在进食后数分钟内出现；非ige介导型主要表现为特异性皮炎、慢性腹泻、脓血便、缺铁性贫血、便秘，湿疹等，部分患儿可出现生长发育迟缓，多于进食后数小时或数天后出现[4]。本研究对象为1～6个月婴儿，以腹泻、脓血便、呕吐、湿疹等为主要表现，发病隐匿，以非ige介导为主，与文献相符。
牛奶蛋白过敏的诊断需要详细地收集病史、喂养史、家族史等多方面的信息。临床常用方法有：牛奶蛋白回避及激发试验、双盲安慰剂对照牛奶激发试验、食物变应原皮肤点刺试验、血清异性ige测定等[5，6]。双盲安慰食物激发试验是诊断牛奶过敏的金标准，此方法诊断周期长，程序较复杂，且条件要求高，目前较少采用。临床上常用的是通过采集临床症状、生长发育情况、家庭过敏史、喂养史及添加辅食等，结合皮肤点刺试验和牛奶回避、激发试验诊断牛奶过敏。临床实践中，小婴儿牛奶蛋白过敏以非ige介导为主，血清异性ige测定阳性率极低。婴儿皮肤娇嫩易致皮肤点刺试验不准确，痛苦较大，故临床仅作为参考。本实验研究对象为小婴儿，其中5例皮肤湿疹，2例家长有过敏性疾病，15例生后奶粉喂养，混合喂养5例，提示病史资料的收集对牛奶蛋白过敏的诊断有重要意义。
牛奶蛋白回避或激发试验对ige介导或非ige介导的过敏反应均有效，简单易行，是目前临床上诊断婴儿牛奶蛋白过敏最常用方法[7]。本实验20例小婴儿临床表现主要为反复腹泻伴/不伴脓血便、呕吐、轻度贫血、皮肤湿疹等迟发型牛奶过敏。既往以急性腹泻病或急性感染性腹泻病治疗无效或不久再次发作，而给予氨基酸配方粉（纽康特）替代饮食或回避牛奶蛋白摄入1周后，大便每日1～2次，性状为黄色糊状，未见肉眼血便及镜下血便；2周内患儿湿疹完全消退。停用氨基酸配方粉再次进食普通配方奶粉及牛奶蛋白后，部分患儿临床症状复发，与本实验结果一致。
牛奶蛋白过敏的治疗主要有环境控制，饮食控制、药物治疗，而回避牛奶蛋白及含牛奶蛋白的食物是治疗的关键。氨基酸配方奶粉是以纯化的氨基酸或寡肽为基础，完全回避了牛奶蛋白，且含有正常量的脂肪和碳水化合物，其营养可保证婴幼儿生长发育的正常需要，是目前解决牛奶蛋白过敏的最好选择。
[参考文献]
[1]陈同辛，张慧.婴幼儿牛奶蛋白过敏症的诊断和治疗指南[J].实用儿科临床杂志，2009，24（21）：1697-1700.
[2]VliegBoerstraGJ，BijleveldCm，VanderHeideS，etal.Deve-lopmentandvalidationofchallengematerialsfordouble-blind，placebo-controlledfoodchallengesinchildren[J].JallergyClinlmmunol，2004，113：341-346.
[3]SichererSH，SampsonHa.Foodallergy：recentadvancesinpathophysiologyandtreatment[J].annuRevmed，2009，60：261-277.
[4]龚四堂.小儿食物过敏的消化道表现[J].中国实用儿科杂志，2007，22（1）：17-18.
[5]张凤娟，孙正芸，程蓓蕾.口服益生菌对早产儿消化道及免疫功能的影响[J].山东大学学报（医学版），2008，46（11）：1069-1071.
[6]张露，林燕妮，梁晓红.67例牛奶蛋白过敏症临床诊治分析[J].当代医学，2011，18（9）：109-110.
牛血清白蛋白篇6
文/王亮
“因为我有糖尿病，所以要控制喝水”，糖尿病患者常有口渴、喝水多的表现，病友们常有一种错误的观点，认为患糖尿病后应该控制喝水，这是大错特错的。喝水多是体内缺水的表现，是人体的一种保护性反应，患糖尿病后控制喝水不但不能治疗糖尿病，反而使糖尿病更加严重，可引起酮症酸中毒或高渗性昏迷，是非常危险的。
①喝水有利于体内代谢毒物的排泄。
②喝水有预防糖尿病酮症酸中毒的作用。
③酮症酸中毒时更应大量饮水。
④喝水可改善血液循环，对老年患者可预防脑血栓的发生。
⑤严重肾功能障碍，尿少、水肿时，要适当控制饮水。
调整饮食防胆色素结石
文/张依秋
胆色素结石在我国是一种多发常见病，其发病率有逐年上升趋势。然而胆色素结石的病因尚不十分明了，且可引发多种合并症。湖北医学院附属第一医院普外科进行一项医学研究证实，胆色素结石的成因与蛋白质营养有关，合理调整饮食结构，有助预防胆色素结石的形成。
科研人员曾从收集的50份胆石标本中，随机取出经红外线吸收光谱鉴定胆固醇结石20份，胆色素结石20份，编号相同的胆固醇结石患者胆汁10份、胆色素结石患者胆汁10份，编号相同的血清40份和正常人血清20份，测定组成蛋白质的17种氨基酸含量。结果表明，胆固醇结石患者血清中氨基酸含量与正常人无差异，而胆色素结石患者血清中氨基酸浓度则低于正常人，从而影响了胆汁中蛋白质的含量。研究证实，胆汁中蛋白质含量的降低是胆色素结石形成的主要原因，血清中氨基酸总量的降低也是胆色素结石的易患因素。
科研人员认为，摄取食物中含蛋白质营养高于一般饮食水准者，胆色素结石的发病率下降。为了较好地防治胆色素结石，患者可适当多吃些富含蛋白质的动、植物类食品，如鱼、虾、瘦肉、家禽、蛋类、乳类、豆类、硬壳果类、五谷类及大白菜、油菜、黄瓜等，以促进人体摄取充足的蛋白质，降低胆色素结石发病率。
痛风者最宜食鸡蛋和牛奶
文/王兴国
痛风的基本病理是血液中尿酸浓度过高，以至于“渗漏”到关节附近的软组织中并形成尿酸盐结晶，并引起严重的疼痛。因为在体内，尿酸是由嘌呤代谢而来的，所以痛风患者（还有高尿酸血症。即只有血尿酸升高，并无疼痛症状）要减少嘌呤摄入——低嘌呤饮食。因为，肉类、鱼类、内脏、大豆制品等富含蛋白质的食物通常含有较多的嘌呤，所以被列为“要少吃或不吃”之列。那么，痛风患者的蛋白质如何来满足呢，最佳选择是鸡蛋和牛奶。
牛奶中不含有嘌呤。这是因为嘌呤实际上是核酸（属遗传物质，如Dna即脱氧核糖核酸）分子的组成部分（碱基对）。核酸是遗传物质，遗传物质一般存在于细胞核之中。牛奶是牛的乳腺细胞分泌的体液，里面没有细胞结构，没有细胞核，也就没有遗传物质，没有核酸，故没有嘌呤。
牛血清白蛋白篇7
这里介绍“菇中八秀”的营养成分、药膳功效及雅典菜谱：
一、羊肚菌，又称蜂窝蘑，学名morchenaesculenm，是一种名贵的食用菌。菇体椭圆形，表面凹凸不平多皱折，形似羊肚，色灰黑，肉质细嫩，齿感清脆香甜。每100g含蛋白质24．5g，脂肪2．6g，碳水化合物39．7g，粗纤维7．7g，灰分11．9g。具有化痰理气、防治肝脏和动脉硬化、降低血清胆固醇、防止坏血病和佝偻病功效。
时新菜谱：“苏武牧羊”(青菜茎衬羊肚菌)、“草原赶羊”(菠菜盖底，点布羊肚菌)、“羊年益寿”(寿面与羊肚菌共煮)、“牛羊结缘”(牛肉丝炒羊肚菌)。
二、牛舌菌，又名牛排菌，日本美食家推崇为肝脏茸和鲜血茸，学名Fistulinahepatica。其菇体状似牛舌和动物肝脏，红褐色如血，肉质细嫩，滑腻松软，带有可口香甜味道及舒适的胶质感。每100g含蛋白质23．4g，碳水化合物48．9g，钙23mg，磷380mg，核黄素3．78g；在氨基酸中含稀有的丁氨酸。具有通经络、益气补血、健肠胃、安心神之功效。
时新菜谱：“鸭掌烩牛舌”(鸭掌脱骨，牛舌菌切片烩煮)、“鸡翅炖牛舌”(鸡翅膀切段，牛舌菌切片煮炖)、“猪牛斗舌”(猪舌菌与牛舌清蒸)、“牛舌尝青”(西兰花铺底，牛舌菌点布摆)。
三、猴头菇，又名刺猬菌，学名H．efinacens。菇体圆肥，披有刺毛，状似猴头，色泽洁白，干品微苦。每100g含蛋白质26．3g，脂肪4．2g，碳水化合物44．9g，粗纤维6．4g，磷856mg，铁18mg，钙2mg，硫胺酸0．69mg，核黄素1．89mg，胡萝卜素0．01mg。其肉质滑嫩，食药两用，能增强人体免疫功能，调节机体平衡，增进食欲，对胃病有特殊功效。曾有“三分病七分养，猴头菇调节肠胃最理想”的民谣。
时新菜谱：“猴闯火焰山”(红烧猴头菇)、“山中无老虎”(猴头菇与糕点、西兰花拼盘)、“群猴戏玉珠”(鹌鹑蛋与猴头菇清蒸)、“难逃如来掌”(鹅掌上摆布猴头菇)。
四、凤尾菇，又名印度鲍鱼菇，学名plenrotuspulmonarius。菇体扇形，似凤尾展翅，乳白色至灰白色，肉质滑爽，鲜美清甜。每100g含蛋白质3．88g，脂肪1．18g，还原糖1．8g，木质素2．64g，纤维素12．85g，果胶0．14g。具有防治血压、宜肠畅胃、散热血等功效。
时新菜谱：“龙凤吉祥”(河鳗与凤尾菇清炖)、“凤凰归巢”(鹌鹑蛋与凤尾菇炒盘)、“鸾凤和呜”(鸡肉与凤尾菇拼盘)、“凤毛麟角”(凤尾菇与菱角共煮)。
五、鸡腿蘑，又名卵鬼伞、毛头鬼伞，学名Copehuscomatuso体态椭圆肥长，状似鸡腿，色泽洁白。每100g含蛋白质25．4g，脂肪3．3g，总糖58．8g，纤维素7．3g，灰分12．5g，热能值1448千焦。其性平味甘，有益脾胃、安心神、助消化、增食欲、治痔疮之效。
时新菜谱：“肉丝素鸡腿”(鸡腿蘑炒肉丝)、“鸡鸭和谐”(鸡腿蘑与鸭肉清蒸)、“鸡鸣起舞”(鸡腿蘑、西兰花、粉丝拼盘)。
六、绣球菌，又名绣球蕈，学名SparassisCfispa。菇体小朵、多瓣组合成绣球状，形态美观，色白，肉质清脆，细嫩爽口，风味独特。每100g含蛋白质15．58g，脂肪7．95g，还原糖48．77g，甘露醇12．93g，含有多种维生素。具有补中益气、调肺、和胃健脾等功效，对肿瘤有拮抗作用。
时新菜谱：“闺房抛绣球”(鸡肉块与绣球菌清炖)、“雪里樱桃红”(绣球菌中点缀红樱桃果)、“云头送子”(绣球菌与莲子炒盘)。
七、珍珠菇，又名滑子磨、真珍菇，日本人叫纳美菇，学名pholiotanamekoLeoetlmaio菇体朵小似珠，色黄，肉质滑嫩，口感甚佳，味道鲜美，自古以来视为珍贵食品。每100g含蛋白质15．13g，脂肪4．05g，总糖38．89g，纤维素14．23g，以及钾、铁、钙等多种矿物质元素，维生素B2、c、D2等，其核酸类物质有恢复体力和脑力的功效，对人体健康十分有益。
时新菜谱：“金玉满堂”(珍珠菇、玉米粒、腰果、肉丁同炒)、“四味珍珠”(珍珠菇加吞酸、食糖、精盐、菇椒粉爆炒，勾芡)、“珍珠抬婿”(青椒与珍珠菇炒盘)。
牛血清白蛋白篇8
在屠宰前，使用注射器对全部试验肉牛进行尾静脉采血，置于10mL不加抗凝剂的离心管中，用记号笔在离心管上记录牛耳号，迅速置于放有冰袋的采样箱中。利用高速离心机以3000r／min离心10min，分离血清，将血清置于－20℃冰箱冷冻保存待测。使用雷杜Rt－200Cplus全自动生化分析仪测定结石组血清的钾（K）、钠（na）、氯（Cl）、钙（Ca）、磷（p）和镁（mg）。1．2．4结石的化学成分分析取屠宰后肾结石样品，将结石样品喷铂金后，在eDaX－Genesis2000型X－射线能谱仪上分析其各元素的含量。1．2．5数据处理所有的数据使用excel2007进行数据统计和分析，结果用平均值±标准差的形式表示。
在40头肉牛的屠宰过程中，共发现23头患有肾结石的肉牛，发病率为57．5％。牛肾为典型的多肾，经剖检可知，结石大多聚集在个别肾内部的肾盂处。肾结石大部分呈现乳白色或淡黄色，其中大多数呈细小的砂粒状结石。有结石的肾主要集中在牛肾的两个尖端处，而中间部分的肾几乎不存在结石。每头牛每天采食10kg的精料和2kg的稻草，计算出每日的干物质采食量（Dmi）、粗蛋白质（Cp）、钙（Ca）和磷（p）的摄入量，并且和肉牛饲养标准进行比较。该肉牛场的干物质采食量（Dmi）略高于营养标准。每日饲料蛋白质的摄入量偏高，钙和磷的摄入量过高，且饲料的钙磷比严重失衡，磷的含量比钙高。血液生化指标的测定使用雷杜Rt－200Cplus全自动生化分析仪测定结石组的血清生化指标，并且将结果与正常肉牛的参考值（王书林，2001）进行对比。结石组的血清钙（Ca）明显下降，而血清磷（p）和血清镁（mg）明显上升，其他离子指标都处于正常的参数范围内。结合表2可知，高磷低钙饲料和血液生化指标的高磷低钙之间存在着相关性。2．4结石能谱分析结果使用X－射线能谱仪测定肾结石的化学成分结果结石的主要化学成分为磷和镁，同时还含有少量的氮和钾。从化学成分分析，初步判断该结石的主要成分是磷酸镁铵和磷酸镁钾的混合物。
长期以来，精粗比过高一直被普遍认为是肾结石的重要诱因之一。munakata等（1974）研究结果发现，当精料的饲喂量达到阉牛体重的1．5％时，尿液中就可以检测到尿沉渣晶体；而当精料的饲喂量占体重的2．5％时，饲喂2个月以上尿中就可以检测到大量尿沉渣，并开始形成结石。该牛场体重为500kg左右的长期育肥阉牛每日精料采食量为10kg，占体重的2％。在该精料比例下，可以缓慢沉积尿沉渣；当尿液中的尿沉渣数量累积到某个阈值时，就会形成结石。此外，育肥时间跟结石的形成也可能有很大关系，该牛场因生产高档牛肉而采取长期育肥方式，有利于尿沉渣的累积，也有可能是结石产生的促进因素。人们普遍认为尿石症是家畜体内矿物质代谢紊乱的结果，其中饲料的钙磷比是学者研究的热点。饲料中合理的钙磷比在1．5～2．1之间，这时的钙和磷均容易被动物体吸收。该肉牛场饲料的钙磷比仅为0．94，远远低于上述比例，出现了磷含量高于钙的现象。据报道，当饲喂大量玉米、麸皮等饲料，钙磷比在1左右时，就会在尿道内形成磷酸镁铵结石。同时，饲料的高磷低钙，会导致进入血液中无机磷的增加，导致血清和尿液的高磷，提高肾结石的发病率（张高轩等，1989）。
牛血清白蛋白篇9
【摘要】目的对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongationfactor1，eF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将亚洲牛带绦虫成虫eF-1克隆到原核表达质粒pet-28a(+)中，在大肠杆菌BL-21/De3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-paGe)进行鉴定，用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化，用蛋白印迹法(westernblotting)进行免疫学分析。结果pCR、双酶切及Dna测序结果均表明重组质粒pet-28a(+)-eF-1构建成功。重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别，表明其具有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫成虫eF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】亚洲牛带绦虫；延伸因子-1；基因克隆；原核表达
aBStRaCt:objectivetocloneandexpressthenovelgenenamedelongationfactor1(eF-1)oftaeniasaginataasiaticainordertoanalyzetheimmunogenicityoftherecombinantprotein.methodsByscreeningthefulllengthcDnaplasmidlibrary，thecodingregionofeF-1wasamplifiedwithpCR，andclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpet-28a(+)andthenexpressedine.coliBL21withiptGinduction.therecombinantproteinwasdetectedbySDS-paGeandpurifiedbyni-iDaaffinitychromatography，anditsimmunogenicitywasanalyzedbywesternblotting.ResultspCR，doubleenzymedigestionandDnasequencingconfirmedthattherecombinantexpressionplasmidwassuccessfullyconstructed.westernblotanalysisofeF-1recombinantproteintestifiedthattherecombinantproteincouldberecognizedbyimmunizingtheserumofswineandpatient，thereforeindicatingitsimmunogenicity.ConclusionanovelgenecodingeF-1oftaeniasaginataasiaticawasclonedandexpressedsuccessfully.thepurifiedproteinofeF-1willbeofimportanceforfurtherresearchonthebiologicalfunctionofthegene.
KeYwoRDS:taeniasaginataasiatica;elongationfactor1(eF-1);molecularcloning;prokaryoticexpression
亚洲牛带绦虫(taeniasaginataasiatica)是近30年来发现的一种成虫形态与牛带绦虫相似，而囊尾蚴却与猪囊尾蚴相似并以猪作为中间宿主的人体带绦虫。2006年我们在前期研究的基础上进一步系统地开展对亚洲牛带绦虫在分类地位、分子诊断和疫苗等方面的研究［1-4］，为制定预防人体带绦虫病策略提供依据。本研究从亚洲牛带绦虫成虫cDna质粒文库中筛选出一个延伸因子-1(elongationfactor1，eF-1)的同源基因，构建了pet-28a(+)-eF-1原核表达载体，并对其原核表达产物进行了初步的免疫学研究，为进一步研究其生物学功能奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清来源
感染亚洲牛带绦虫猪血清由贵阳医学院寄生虫学教研室提供，患者血清采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，健康人血清由中山大学热带病重点实验室提供。
1.1.2文库、质粒、菌株
虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，亚洲牛带绦虫成虫全长cDna质粒文库的构建、eSt测序及Unigene分析与上海联合基因有限公司合作完成。原核表达质粒pet-28a(+)和大肠杆菌BL-21/De3由中山医学院病原生物学实验室保存。
1.1.3主要试剂和工具酶
extaq酶(含dntp)、ecoRⅠ、XhoⅠ、t4Dna连接酶及Dna标准(DL2000)均购自大连宝生物工程公司；异丙硫代-β-D半乳糖苷(iptG)购自美国promega公司；ni-iDaagarose(catno：69670)购自美国novagen公司；蛋白分子量标准购自立陶宛mBi公司；Dna凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京赛百盛基因公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪igG二抗、DaB(3，3二氨基联苯胺)显色试剂盒均购自武汉博士德有限公司；pVDF膜购自millipore公司；tmB显色试剂盒购自美国BD公司；SDS、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、尿素等试剂均购自上海申友生物科技公司。
1.1.4引物合成和Dna测序
基因扩增引物和重组质粒Dna测序由invitrogen上海生物技术有限公司合成。
1.2方法
1.2.1eF-1基因的识别
将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析，获得编码亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因文库质粒编号为t.aHC23-e9，GenBank登录号为eF420501的同源基因；并通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(expaSY，ca.expasy.org/)预测其理化特性。
1.2.2eF-1基因的扩增根据已获得的eF-1编码序列，利用DnaClub和pCRdesign设计引物。上游引物：CtaGaattCatGGaGtGtGCGttGaaGttC，带ecoRⅠ酶切位点；下游引物：GGGCtCGaGttaCaatttGttGaaGGaaG，带XhoⅠ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDna文库中eF-1基因的克隆质粒为模板，94℃预变性5min后，热循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。pCR产物10g/L琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3重组原核表达质粒［pet-28a(+)-eF-1］的构建及鉴定
将pCR产物和原核表达质粒pet-28a(+)经ecoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，连接、转化大肠杆菌BL-21/De3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行pCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.4重组蛋白的表达
将确定能表达重组蛋白的单菌落接种于5mLLB培养基中，过夜培养后1∶100转接到1000mL培养基中，培养至a600约为0.6时加入iptG至终浓度为1mmol/L，28℃、250r/min进行诱导。诱导4h后离心收菌，用SDS-paGe检测蛋白质的表达。
1.2.5菌体的裂解、重组蛋白可溶性判断及待纯化融合蛋白上清的制备
取单菌落接种于1000mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至a600为0.6时，加入iptG使其终浓度为1mmol/L，28℃震荡培养4h，4℃离心(6000g×10min)，收集菌液，按文献［5］的方法，每克菌(湿重)加入3mL裂解缓冲液，重悬细菌沉淀，裂解液冰上超声破碎(160w，超声1s，停2s，超声5min)，4℃13000r/min离心20min，收集上清和沉淀，分别取上清10μL加入4×SDS上样缓冲液和沉淀微量加1×SDS上样缓冲液，煮沸5-10min后行150g/LSDS-paGe判断重组蛋白的可溶性。
1.2.6尿素变性纯化重组蛋白
在得到的包涵体(超声后沉淀)中加入a液10mL重悬，4℃12000r/min离心15min，弃上清，重复2次，再用B液洗涤1次，4℃6000r/min离心15min。将洗涤后的包涵体沉淀加入8mol/L尿素(溶于基础液)18mL放置1h左右，沉淀完全溶解，溶液清亮透明。采用透析法，逐步降低尿素浓度(8-6-5-4-3-2-1mol/LpBS溶液)。
1.2.7westernblotting检测重组蛋白的免疫反应性
将纯化的蛋白进行120g/LSDS-paGe电泳，使用电转移仪于100V冰浴转印1.5h，将蛋白转移至pVDF膜上，将含预染蛋白marker条带剪下，pVDF膜转入感染亚洲牛带绦虫猪和患者血清中(1∶100稀释)，室温孵育2h，pBS洗涤3次，每次5min。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪和抗人igG(1∶2000稀释)，室温孵育1h，pBS洗涤3次，每次5min，DaB显色至出现目的条带，超纯水终止反应［6］。
2结果
2.1生物信息学分析
该基因与细粒棘球绦虫eF-1基因(登录号为aaF641192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%；全长988bp，编码区67-868，编码269个氨基酸。理论分子质量和等电点分别是28067.8u和4.88［7］。
2.2原核重组质粒的鉴定
将重组质粒进行pCR和双酶切鉴定，产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500-1000bp之间有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.3蛋白表达纯化结果
将构建好的重组质粒转化到e.ColiBL-21/De3中表达，SDS-paGe电泳分析结果如图2中第4、5泳道所示，大约在34ku左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。通过破包涵体，将蛋白进行纯化，结果如图2中第6、7泳道所示，其位置与目的蛋白相符，证明目的蛋白纯化成功。
2.4westernblotting鉴定
感染亚洲牛带绦虫的猪血清以及感染亚洲牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的westernblotting均显示出清晰的条带(图3)。
3讨论
研究表明，eF-1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、翻译过程中起重要作用［8］。eF-1可能由α、β、γ、δ四个亚基组成，其中eF-1α属于G蛋白家族，它和氨酰tRna、Gtp一起组成复合体，通过正确地识别mRna上的密码子和tRna上的反密码子，负责转运氨酰tRna到80S核糖体，并具有低水平Gtp酶的活性。eF-1β具有鸟苷酸交换活性，在eF-1α从核糖体离开并且构象由GDp形式变成Gtp准备与新的aa-tRna相互作用的过程中，需要eF-1β作为催化剂。eF-1γ常与eF-1β形成复合物，具有增加后者鸟苷酸交换的功能。至少在脊椎动物中，eF-1还有第四个亚基eF-1δ，尤其在其羧基端与eF-1β具有同源性，而在氨基端无同源性，表明它们可能具有不同的功能［9-10］。我们从亚洲牛带绦虫cDna文库中识别出了一个eF-1的全长编码基因，其编码的氨基酸序列与GenBank中细粒棘球绦虫的eF-1基因(登录号为aaF64192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%，推测其为亚洲牛带绦虫eF-1基因，并且含有完整的开放阅读框，是一个全长cDna序列。
通过生物信息学分析，该蛋白的理论分子质量为28067.8u，而质粒pet-28a(+)的载体标签序列的分子质量为6ku，所以重组蛋白的分子质量大约应为34ku。图2的4泳道显示的重组蛋白条带与预期的大小是一致的，并且条带很浓，但从该图的5泳道看出上清没有表达，说明该蛋白是以包涵体的形式表达，通过尿素变性纯化重组蛋白，得到了条带很浓的纯化蛋白(图2第7泳道)。本研究为包涵体蛋白的纯化积累了经验，同时还证实了重组蛋白在纯化后具有免疫反应性，获得了具有免疫活性的重组蛋白，为进一步研究其生物学功能以及在诊断尤其是疫苗研究方面的作用奠定了基础。
参考文献
［1］FanpC，LinCY，ChungwC.experimentalinfectionofphilippinetaeniaindomesticanimals［J］.inJparasitol，1992，22(2):235-238.
［2］包怀恩.我国亚洲牛带绦虫研究的现状和展望［J］.热带医学杂志，2002，2(3):215-219.
［3］黄江，胡旭初，包怀恩，等.亚洲带绦虫成虫全长cDna质粒文库的构建及eSt测序［J］.热带医学杂志，2007，7(2)116-118.
［4］黄江，胡旭初，包怀思，等.亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆和生物信息学分析［J］.中国病原生物学杂志，2008，3(1):56-59.
［5］萨姆布鲁克J，弗里奇eF，曼尼阿蒂斯t.分子克隆实验指南［m］.第2版.北京：科学出版社，2002:822-849.
［6］Harlowe，LaneD.抗体技术实验指南［m］.第1版，北京：北京科学出版社，2002:161-170.
［7］庞建新，黄江，胡旭初，等.亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析［J］.热带医学杂志，2007，7(6):513-515.
［8］andersenGr，nissenp，nyborgJ，etal.elongationfactorsinproteinbiosynthesis［J］.trendsBioSci，2003，28:434-440.
牛血清白蛋白篇10
一、牛奶抗衰老延年益寿
明代医药学家李时珍在《服乳歌》中写道:“清晨能饮一升余,返老还童天地久。”总结出了牛奶的保健功能。现代医学研究证实,牛奶含有一种生物活性物质,即“SoD”,它能有效地清除人体内的“自由基”等有害物质(即所谓体内垃圾),从而增强人体免疫功能,促进新陈代谢,延缓衰老。
据美国《营养学杂志》介绍,人们完全可以把牛奶看成是低脂、低胆固醇食品,并指出,牛奶富含的蛋白质在人体的消化吸收率达97%,也是维持老年人正常脑体活动的必需物质。所富含的钙和磷,能有效防治老年人极易出现的骨质疏松症,其中磷元素还有助于延缓脑细胞衰老而增强记忆力。所富含的维生素a,对老年人常见的眼角质软化、干燥性眼炎及夜盲症等均有辅助治疗作用。牛奶中所富含的维生素类物质,还能减少皱纹、滋润皮肤和防止老年瘙痒症。
二、牛奶防癌抗癌
牛奶中的β-酪蛋白,具有较强的抗癌变功能,牛奶在胃内形成乳酪,而乳酪中的共轭亚油酸,有软化血管,降低血清胆固醇和抗胃癌的作用。
德国慕尼黑大学医学研究所日前发表的一份报告指出,常饮牛奶有助于防止乳腺癌。报告说,牛奶的饮用量与乳腺癌发病率明显成反比。每天喝0.5千克牛奶的妇女中没有发现乳腺癌患者,而在88名患乳腺癌的妇女中调查发现,她们几乎没有喝牛奶的习惯。说明牛奶所含的乳糖和钙质对抵制乳腺癌有特别的作用。
澳大利亚学者研究发现,牛奶中的乳脂含有多种抗癌化合物。他们在动物实验中获知,乳脂中含有能阻止各种肿瘤生长的结合亚油酸,这是一种须从食物中补充的必需脂肪酸。结合亚油酸能抑制人体内的恶性黑色素瘤、直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等癌细胞株的生长,乳脂是结合亚油酸含量最丰富的天然食品。所以,经常喝牛奶可防癌抗癌,有利于健康。
三、牛奶可以降血压
血压与钙的摄入量密切相关。牛奶含有丰富的钙质,如果每天喝两包软包装鲜奶,就可摄入500毫克的钙。常喝牛奶,摄入的钙质增多,高血压发病率就可降低,起到降血压的效果。
专家们通过临床观察,发现牛奶中的矿物质元素钾、钙、锌和蛋白质、蛋氨酸等,都具有稳定人体情绪和降低血压的作用。同时,牛奶中所特有的乳清酸成分,还具有降低血液中胆固醇含量、提高蛋白质水平、降低心肌张力和保护心脏的功能。高血压、冠心病及胆固醇偏高的心血管疾病患者,宜经常食用牛奶,它可起到辅助治疗作用。
四、牛奶对于胃溃疡、十二指肠溃疡和萎缩性胃炎患者很有益处
牛奶中的蛋白质加热后会发生变性,这些变性的蛋白质及奶中的磷脂类物质会紧紧地吸附在胃壁上,对胃黏膜起到保护作用,并刺激胃黏膜下壁细胞分泌,使已受伤的胃黏膜得到修复。同时奶有成分,即乳糖分解代谢所产生的乳酸及葡醛酸等还能增加胃内酸度,抑制有害菌分解蛋白质产生毒素,使胃免遭毒素的侵蚀,从而利于胃炎的恢复和治疗。
五、牛奶预防胆结石
每天临睡前喝一杯牛奶,可起到排空胆囊、避免胆汁浓缩、阻止胆囊内形成小结石的功能。但应注意,如果第二天不定时吃早餐,那么前一天晚上所喝的牛奶就会失去作用。
六、牛奶催眠
牛奶中的色氨酸,对人体有安神促眠的功能,尤其对体质虚弱经常失眠的人,效果明显。每天晚上临睡前喝一杯牛奶,半小时后便可入睡。