基因组学研究篇1
【摘要】该文基于现代基因组学特别是功能基因组学及一些生物技术手段的研究进展及发展趋势，从一个新的视角提出了开展“中药基因组学(tCmGenommics)”研究的策略。认为当前中药的现代化研究应集中体现于中药基因组学，并将以基因芯片等为核心的基因技术引入中药基因组学和现代中药研究。将中药的作用机理或功能利用能代表其功能的一组基因表达的影响来诠释。
【关键词】基因芯片;中药基因组学;中药现代化
abstract：inthispaperanewresearchstrategyof“tCmGenomics”isproposedonthebasisofachievementsandadvancesinthefieldsofHGp，biochipproteomics，biotechnologyandmodernanalytictechnologies.inordertoelucidatetheactionorfunctionoftCmwithitsregulationtoagroupofgenesthatrepresentthisactionorfunction.wepresumethatmodernizationoftCmshouldfocusontCmGenommicsandapplygenetechnologycentredupongenechiptotCmGenommicsandmodernresearchoftCm.
Keywords：Genechip；tCmGenommics；modernizationoftCm
化学曾经在中药研究与开发领域扮演了极为重要的角色，但今天药物研究与开发的基础已经由化学转变为生物学，尤其是分子生物学、基因组学和生物信息学。基因芯片作为20世纪90年代新兴的高度集成化的分析和研究手段，正在成为进行药物基因组学研究的主要平台。本文就基因芯片技术在中药基因组学研究中的应用进行综述。
1基因芯片和中药基因组学的含义
基因芯片（genechip）又称Dna芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前运用最广泛的微阵列芯片。它是指在固相载体上按照特定的排列方式固定大量序列已知的Dna片段，形成Dna微矩阵。将样品基因组Dna/Rna通过体外转录、pCR/Rt-pCR扩增等技术掺入标记分子后，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量的基因序列特征或基因表达特征信息［1，2］。
药物基因组学是分子药理学与分子生物学有机结合，研究药物效应基因的变异与药物效应之间的关系，其中所包含的中药基因组学(tCmGenomics)则是通过现代科技手段结合传统中药理论和现代科学理论，将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达和调控的影响关联起来，在分子水平上用现代基因组学，特别是用功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中药理论及作用机理［3］。
2基因芯片在中药基因组学研究中的应用
基因芯片是研究分析基因的一种强有力的分子生物学技术，是进行表达中药基因组学研究的主要工具［4］。通过中药基因组学研究，可开发中药基因芯片。中药基因芯片作为“中药基因组学”的又一重点，将从根本上改变长期以来人们对中药的研究手段和认识层次。中药基因芯片将是高通量、高效率的从分子水平上研究中药的最新技术手段。中药基因芯片包括分类、鉴定芯片和药物筛选芯片两种重要类型，前者可以用于对中药材料及制成品的定性、定量分析，在药物鉴定、质量保证方面具有极为重要的应用价值，还可用于寻找、发现中药新基因；后者用于中药的药效筛选以及药理分析，还可用于证实、发现中药新品种。
而在药物的遗传学研究中，基因芯片是进行候选基因的多态性筛查的有效手段。目前研究表明大部分人基因高频等位基因变异，而约有90％的变异是单核苷酸多态性(Snp)［5］，在人类基因组上大约有142×108Snp。而这些Snp构成了大部分人类多样化表型的遗传基础。将影响药物反应的所有多态性基因置于一张芯片上作为临床分子诊断工具，用来选择适于个体的合适药物治疗方案和剂量，是实现个体化给药的前提［6～8］。
2.1药靶的研究药靶确切的含义是指药物直接作用的生物大分子物质，选择合适的药靶是基于机理筛选药物的关键因素之一。目前已知可作为药靶的基因约500个，Drews和Roses等［9，10］认为，在人类基因组中可用于疾病治疗的药物靶点有3000～10000个。由此可见，在药靶的发现与研究领域还有相当的空间，而我国具有数千年临床研究与应用历史的中药，在这一领域具有得天独厚的发展优势。中药对一些疑难杂症具有良好疗效，但在药靶及其作用机制的研究方面则非常薄弱，基因芯片技术的应用将有助于改变这一局面。利用基因芯片技术通过比较正常组织（细胞）及病变组织（细胞）在有效药物或者没有药物作用下的基因表达水平的变化，从而发现一组疾病相关基因或者药物反应基因作为中药筛选靶标。利用此技术可以找到多重药物反应基因，这些药物反应基因提供了多重干涉节点，这些反应基因可能会成为新的药靶，用于筛选新的中药品种，扩大中药药源，也可以成为协同治疗方案开发的基础。使中药的性味归经理论以及复方配伍理论和中药的作用靶点在基因组的水平上结合起来，真正在分子水平上诊病、治病。不仅为一些新基因的功能研究提供了线索，而且为研究中药作用的分子机制提供了一个新的技术平台。mandel等［11］利用基因芯片建立帕金森病的基因表达指纹（fingerprints）图谱，发现了多种有利于抗帕金森病药物研制和开发的潜在药靶。
2.2中药作用机制研究由于单味药成分的复杂性以及传统复方和民族药的多样性等特点，中药疗效的发挥可能涉及到多个药效靶点，在以往的研究中往往采用免疫组织化学法、流式细胞仪检测法等，需要将每个样品分别进行测试，操作繁琐，而且不能从生物整体系统的角度探讨药物的作用机制，使得中药作用机制的研究遇到很大困难。大量研究发现，许多疾病与基因结构、基因调控和表达异常有关，而用中药治疗这些疾病能取得显著疗效且毒副作用小。因此，从基因水平上研究中药治病的机制就显得非常有意义。基因芯片技术的出现及发展给中药作用机制的研究提供了有力的工具。
药物与细胞相互作用，将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活动的变化可集中表现在其基因表达的变化上。基因芯片能够确定靶组织的基因表达模式，可将中药作用的所有靶基因全部显示出来，从而提供了在全基因组的基础上了解药物作用机制的线索。由基因芯片所获得的大量信息也可以用来阐述直接药效下游的药物反应个体差异，从而从基因组的高度，在分子水平上解释中药药证、方证的基因组原理，发现、研究中药在人类基因组上的整体作用原理，即基因组药理；研究方剂对基因组的整体作用原理，在分子水平上进一步把方剂精确化、简单化或者分子化，把中药的作用机理推向分子水平。Yin等［12］在用cDna微阵列研究半枝莲（ScutellariabarbataD.Don）的抗癌机制中发现16个基因(包括Dna损伤、细胞周期调控、蛋白质磷酸化的相关基因)上调了5倍以上，提示这些过程可能参与了半枝莲诱导的癌细胞死亡。Bonhamp等［13］采用cDna芯片分析一种中药成分pC-SpeS治疗前列腺癌的作用机制，发现该成分作用于LnCap前列腺癌细胞株24h后，有156个基因表达发生了改变。有趣的是，编码细胞周期调控蛋白、α和β微管蛋白及雄激素受体的基因表达都下调，提示pC-SpeS介导的细胞毒作用可能是调控细胞周期、细胞结构及雄激素反应的基因改变的结果。
2.3中药毒副作用研究由于中药的作用机理是复杂的，在传统意义上讲是通过调节机体的整体功能而起治疗作用。利用传统药理毒理研究方法，对中药从整体、器官、细胞乃至分子水平很难进行较全面的评价。在中药提取物作用于动物的前后阶段，利用基因芯片技术将动物特定的细胞中相关功能基因表达差异变化进行对比，将中药的毒副作用与基因表达特征联系起来，通过基因表达分析便可确定药物的毒性，使得中药的毒副作用或不期望出现的效应在临床前实验得以确认。利用基因芯片可以在一个实验中同时对成千上万个基因的表达情况进行分析，为研究中药对生物系统的作用提供全新的线索。该技术可对单个或多个有害物质进行分析，确定药物在低剂量条件下的毒性，分析、推测毒性物质对不同生物的毒性可比性［14，15］。如果不同类型的有毒物质所对应的基因表达谱有特征的规律，那么，通过比较对照样本和有毒物质的基因表达谱，便可对各种不同的有毒物质进行分类，在此基础上通过进一步建立合适的生物模型系统，便可通过基因表达谱变化来反应中药对人体的毒性［4］。Kiela等［16］在研究印度乳香(BoswelliaserrataRoxd)的提取物时发现该药高剂量不仅不改善肠炎的症状，而且利用基因芯片分析肝脏基因的表达谱时发现，高剂量组中与脂质代谢相关的大量基因表达的失调，表明高剂量给药时，该药具有肝毒性。
2.4中药有效成分筛选由于技术手段的限制，传统的分析方法在中药有效成分筛选方面大多集中在采用化学或物理方法对中药的有机化学成分（如黄酮类、甾醇类、苷类等）进行分析及合成，然后利用细胞及动物评价药效，关心的只是某一种中药或某一种药理作用，而完全忽视了中药特别是复方制剂的多重作用及中药的整体治疗观。特别是采用有机溶剂提取化学成分的分析方法，与中药的水煎口服以摄取水溶性成分为主的用药途径之间可能存在差异和矛盾。另一方面，由于很多中药有效成分是以微量化学成分形式存在的，而传统的有效成分分析、提取技术难以胜任这一工作。因此往往历经千辛万苦最终所获甚少，即使偶有成功，也难成就中药理论，进而怀疑甚至不相信中药理论的科学性。如何解决这类问题，是中药现代化领域备受关注的焦点之一。而基因芯片技术是解决这一问题的主要手段。
中药有效成分的筛选采用基因芯片进行基因表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。这给中药有效成分的筛选提供了一种便利的方法。一种中药有治疗效果主要是通过调节机体部分或整体机能而实现。从基因组的观点看，就是通过对基因的表达调控而起作用。据此，通过基因芯片技术，分析某种中药成分使用前后整个机体的不同组织、器官基因表达差异，就可以从众多的中药成分中迅速筛选到起作用的有效成分。同时可以了解这种成分的作用靶点。这不仅仅是为了弥补传统方法的缺陷，更重要的是在中药新药研究领域，建立全新的理念和先进的研究手段，使中药现代化真正进入一个宽广的良性发展的轨道。
据报道，香港科技大学生物技术研究所利用基因芯片技术已筛选到知母的23种有效成分，如果再从cDna表达文库中得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。
2.5与药物代谢转化相关基因的研究探讨中药与其治疗疾病基因间的作用关系，为丰富基因组学研究和推动中药作用机理研究将起到积极的作用。在中药中含有数百种甚至更多的具有生物活性的物质，它们对于维持人类的健康起了很大的作用，特别是一些植物的代谢产物，能影响细胞的信号传递、基因表达，最终影响整个生物体。有研究表明这些生物活性物质深度地影响了有机体的生长与发育，有机体的基因型也强烈地影响了对所摄取的分子的生理反应。不同的发病原因可能造成相同的类型，而且不同的基因型会导致不同的疾病易感性和对药物不同的耐受能力［17］。用药也需因人而异。凡此种种，都是由不同个体的遗传学差异引起的，从药物反应的角度来说，是机体内的药物应答相关基因决定了个体对药物反应的差异。人群中存在的遗传多态性对个体疾病易感性和药物反应有影响。人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要作用［18］。而基因芯片提供了全基因组范围的扫描多态性的工具，可以同时检测一个个体成千上万个多态性位点。检测出各种单一成分或复方成分的药物应答相关基因、以及各种成分对药物应答相关基因的作用特点［19］。对少数个体用传统的Dna测序等方法发现Snp，根据这些Snp信息设计芯片，就可以对大量个体进行再测序。基因芯片的Snp分析能够帮助研究者将疾病患者分成“反应者”和“非反应者”，应用到中药基因组学中，将能够预测那些个体可能会产生严重副反应，从而为每个患者选择最合适的药物治疗方案。此外，还可以利用基因芯片技术通过基因组扫描技术鉴定和疾病相关的点突变，开发和重新定义诊断方法，建立个体化药物检测指标，帮助预测治疗反应［20～22］。
目前单核苷酸多态性只是用于作为基因组上的位置标记，希望利用它们在染色体上距离的远近找到与特定标记功能相关的多态性。这样基因组范围的相关研究，已经用于发现疾病易感基因，如哮喘和胰腺癌。但是这项技术也适用于定义那些涉及药物反应的基因。基于基因型对患者进行细分类，可以抢救一些在标准临床实验中因为无法接受的毒性发生率而被淘汰的有用的实验药物，这类药物可能对某类细分人群毒副作用率低［23］。减少药物的不必要淘汰，提高新药批准率。
2.6中药质量控制能够准确地鉴定中药是保证中医临床用药安全有效、可持续发展的前提。常规的中药鉴定是采用性状、显微、物理、化学等方法。这种依据形态和解剖学特征及化学成分为基础来进行中药材鉴定的方法有着方法简便、易行等优点。但是，当缺乏完整的形态结构，特别是对中药复方制剂中药用组分的鉴别，用常规的方法“鉴定”就显得异常复杂甚至无能为力。基因芯片技术为我们提供了一种全新的方法。我们可以从正品中药的基因组中分离出Dna与基因芯片杂交就得出标准图谱。从欲鉴定的中药的基因组中分离出Dna与基因芯片杂交就得出工图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出欲鉴定中药的Dna信息。从而可以便捷、准确进行单味中药及中药复方制剂的鉴别。这种基因芯片鉴定技术以其快速、高敏、经济、平行化、自动化等特点，将成为中药物种的分类鉴定、识别假冒伪劣药材现代化的新技术。此外，用于检测基因表达水平的Dna芯片已研究完成，应用该技术通过定量分析可进行复方制剂质量的标准化研究等。
杨忠等［24］首先提取来自多种贝母根茎的基因组Dna，对26SDna基因D2与D3区的多态性片段进行直接测序，将针对不同种属多态性片段的特异性寡核苷探针点制于经多聚赖氨酸处理包被的芯片。然后设计特定引物，用来自不同种属贝母的pCR产物与固定的寡核苷探针进行杂交，由于在pCR反应过程中使用了荧光素标记的ddntps，不同贝母种属即可在芯片不同位置检测到荧光信号，从而提供了一种快速高效的集基因分型和中药鉴别于一体的方法，显示基因芯片技术可为植物种属的验证与质量控制提供一种快速、高质量的检测工具。
除上述基因芯片在中药基因组学研究中的应用外，利用基因新片技术还有助于从整个基因组的水平来阐明重要的、常用的或珍稀濒危品种的植物性中药基因在染色体的位置、结构、基因及其产物的功能、基因与基因之间的相互关系，搞清功能基因和次生代谢的酶基因，进而进行“工厂化生产”或“田间种植”［25］。
3结论
我们的传统中医药学在历史上对中华民族的健康发挥了重大贡献，但是和现代药物相比较，还具有很多缺点。我们应结合科学的整体论基础和现代的科学技术，将中医药学的优秀思想和最先进的科学技术相结合，建立完善的中医药特色的基因组学，吸收现代医药学的优点，扬长避短，才能完全发挥中医药的特色，科学解释、发展和完善中药学，使其成为一门崭新的生命科学，为人类的健康作出新的贡献。
将基因芯片技术应用到中药基因组学，一方面可以加速中药基因组学的发展，主要是利用基因芯片技术进行基因功能及多态性的研究，以确认与药物效应相关的基因，并查明这些基因的多态性；另一方面利用中药基因组学的研究成果，结合基因芯片技术，可以将人类按基因型分群，以实现中药基因组学研究的目的和价值。因此基因芯片在中药基因组学研究中有着重要地位。
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基因组学研究篇2
关键词：功能基因组；西瓜；甜瓜；黄瓜
功能基因组学（functionalgenomics），又被称为后基因组学（post-genomics），它是利用结构基因组学提供的丰富信息和产物，借助高通量、大规模的试验分析方法，在全基因组或系统水平上研究基因的功能，弄清生物体中各组分是如何工作并形成有功能的细胞、组织及整个生物体[1]。其目标是明确基因组中全部基因的功能，揭示植物生长发育、环境应答互作的分子网络，从而全面阐释植物的生物学基础。目前，水稻、拟南芥等模式植物功能基因组学研究发展较快，近几年随着科技进步和资金投入的不断增加，葫芦科作物基因组研究也取得了一定的成果。西瓜基因组全长约425mb，甜瓜约450mb，黄瓜约376mb[2]，基因组大小比较适合开展基因组测序和功能基因组研究。2007年由西班牙牵头组织，美国、中国、法国、以色列、日本等国家的14个实验室联合启动了国际葫芦科基因组计划（internationalCucurbitGenomicsinitiative，iCuGi），该计划为瓜类蔬菜的基因组学研究奠定了良好的技术平台。在此基础上，2008年相继启动了葫芦科三大作物西瓜、甜瓜、黄瓜的全基因组测序计划[3]。随着基因组测序工作的陆续完成，瓜类作物基因组研究逐步进入到功能基因组研究时代。本文综述了近些年植物功能基因组学主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黄瓜上的应用概况。
1高通量、大规模eSt测序及功能解析
eSt（expressSequencetag）是指通过对cDna文库中随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDna的5’或3’端序列，长度一般为150～500bp。eSt是基因编码序列的一部分，通过与数据库中已知功能的基因序列进行对比，从理论上可推测其基因功能。eSt已发展成为新基因发现的有效途径，也是植物功能基因组学研究的重要工具。随着测序技术的不断改良和测序成本的降低，高通量、大规模eSt测序及功能解析开始广泛应用。
西瓜eSt研究方面，a.Levi等[4]通过与叶片cDna消减杂交构建了西瓜果实发育不同时期（授粉后12、24、36d）果肉消减cDna文库，获得了832条无冗余eSt，序列比对分析表明有410个eSt-unigenes与已知编码蛋白的基因同源，按功能归类分属于初级代谢、氨基酸合成组装、细胞膜运输、细胞分裂、细胞壁代谢、细胞骨架和细胞形成、基因转录和表达、信号转导、抗性防御和次级代谢。这些潜在的功能基因序列为日后开展西瓜果实发育和品质形成的遗传与功能基因组研究奠定了基础。吕桂云等[5]通过构建枯萎病菌诱导的西瓜根系组织SSH-cDna文库，对测序获得的4431条高质量eSt序列进行聚类拼接，获得1756个非重复序列，基因功能分类表明抗病与防御相关基因约占36.3%，对获得的西瓜与枯萎病非亲和互作中部分特异性表达的基因进行了初步探讨，发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因及茉莉酸和木质素2个主要代谢途径。Guo等[6]采用Roche/454新一代测序技术，从西瓜4个果实发育期（授粉后10、18、26、34d）获得了577023个高质量eSt，组装成了75068个unigenes，有54.9%的unigenes与GeneBank中的已知基因同源，其中2/3来源于黄瓜。Geneontology（Go）注释表明，有33853个unigenes（45.1%）获得至少1个Go术语，被注释序列的基因功能分属于分子功能（molecularfunction）类别、生物过程（biologicalprocess）类别和细胞组分（cellularcomponent）类别，所占比例分别为38.6%、38.6%和36%，另外大约29%的unigenes同时具有以上3种功能分类。生物过程类别的基因主要参与细胞过程、代谢过程和生物合成过程，表明果肉组织在发育过程中发生了广泛的代谢活动。数字基因表达谱分析及实时定量pCR验证表明有3023个基因在果实发育不同时期存在显著的表达差异，表达量差异至少在2倍以上。研究发现细胞壁相关基因在未成熟白瓤果肉组织中高效表达，而类葫芦卜素代谢基因（八氢番茄红素合成酶和番茄红素-β环化酶）、蔗糖代谢基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果实发育不同时期差异表达明显，作者对与果实品质相关的一些生化途径如纤维素合成、木栓质合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等进行了进一步鉴定。
甜瓜大规模eSt测序及功能解析方面，nuritKatzir等[7]通过构建甜瓜eSt数据库，从4800条序列中鉴定出与甜瓜果实香味代谢相关的3类基因家族，乙醇乙酰转移酶、倍半萜合酶和类胡萝卜素裂解双加氧酶，克隆得到候选基因的全长序列，研究了这些基因在不同甜瓜品种间的表达模式。DanielGonzalez-ibeas等[8]通过对8个来源于甜瓜不同组织和生理状态的cDna文库（包括授粉后15d和46d的2个果实的文库）测序和序列拼接、组装，获得16637个无冗余eSt。通过与拟南芥基因组做生物信息学比对分析，发现众多个与果实发育相关的基因，如aCC合成酶、aCC氧化酶、细胞壁代谢酶、类胡萝卜素合成代谢酶、maDS-box基因等。实时定量pCR表明在果实成熟期乙烯受体基因ein4表达量翻倍，表明该基因与果实成熟期乙烯信号调控相关。maDS-box基因SVp在果实成熟期表达量下降了4倍，番茄红素ε环化酶基因（LUt2）和木葡聚糖内糖基转移酶基因（tCH4）表达量也下降了4倍。2011年，ChristianClepet等[9]构建了4个不同类型甜瓜品种不同植物组织的11个全长cDna文库和4个标准化cDna文库，分别获得71577条和22179条eSt，能够组装成24444条unigenes，基因对比显示有75%～85%的序列与双子叶植物同源，70%与单子叶植物同源，有6972个基因家族在双子叶植物和单子叶植物间具有保守性。对数字基因表达谱研究，结果表明有175个基因为组织特异表达，这些基因为未来开展功能基因组研究提供了宝贵的资源。作者从这些序列中鉴定出了4068个SSR和3073个Snp，并对1382个全长转录组进行了分析。为了解甜瓜对盐胁迫的抗性反应机制，Shiweiwei等[10]构建了耐盐甜瓜品种根系组织的抑制消减杂交（SSH）cDna文库，测序获得262条uni-eSts，有161条序列与已知基因高度同源，128条与未知功能基因同源，有很多基因显示与生物和非生物胁迫相关。研究表明，甜瓜耐盐受众多蛋白质调控，这些蛋白涉及细胞代谢、能量、转录、信号转导、蛋白质命运以及细胞拯救和防御等生物过程，表明甜瓜作物耐盐存在复杂的抗性反应机制。
在黄瓜上面，Dae-JaeKim[11]构建了黄瓜子叶生长不同时期的cDna文库，筛选出大量与衰老相关的基因，利用半定量Rt-pCR分析了365个克隆，发现有很多基因表达量提高，这些基因有些功能已知，有些功能未知。齐晓花等[12]采用SmaRt技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系Jin5-508的叶片cDna文库，利用该文库随机挑选的8352个克隆从5’端进行单向测序，共获得8035个有效的eSts，序列的平均长度为838bp。从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因，约占unigene总数的72.5%，1991个unigenes获得分子功能注释，其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%；在获得功能注释的unigene中，有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达，其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因mlo2、mlo8和mlo14高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建黄瓜胚胎发育早期和晚期差异表达cDna文库，经反向northernblot杂交检测，共得到97个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接，共得到93个Uni-eSts，其中包括86个singletons和7个contigs。将上述eSt序列在GenBank上进行BLaSt比对，有83个eSt片段找到了与之匹配的同源序列，有10个eSt片段未找到同源序列，推测可能是新基因。其中很多eSt与拟南芥、水稻或玉米蛋白质数据库中的热激蛋白具有很高的同源性。将以上序列进行功能分类，发现在胚胎发育早期细胞防御和代谢过程占主要位置，而在胚胎发育晚期细胞防御和抗渗透胁迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黄瓜全雌系和雌雄同株系测序获得353941条eSt，其中188255条来源于全雌花，165686条来源于雌雄花，结合5600条GeneBank收录的eSt和mRna序列，组装成了81401条unigenes。通过基因功能注释和分析，预测了343个生化代谢途径。对数字基因表达分析，表明大约200个基因在不同花性型存在差异表达，为研究植物花分化的分子机理提供了新的认识。潘宇等[15]构建了黄瓜授粉前后多个发育阶段的幼果组织cDna文库，测序获得116条eSt，92.2%的长度在400bp以上，19%为重叠序列。在GeneBank中进行BLaSt分析后确认与已知功能基因相似的eSt序列有71条，有相似序列而功能未知的基因和没有相似序列的eSt序列各占19.83%和18.97%。
2tiLLinG技术
tiLLinG（targetinginducedlocallesionsin
genomes，定向诱导基因组局部突变技术），该技术借助高通量、标准化的检测手段，快速有效地从经化学诱变剂（emS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变。与传统的插入突变比，tiLLinG技术利用传统的化学诱变获得突变体，不需要耗时的转基因和复杂的组织培养过程，具有高通量、低成本、高效率等诸多优势。目前，tiLLinG作为一种全新的反向遗传学研究方法已经用于多种植物。
tiLLinG技术在葫芦科作物上的应用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakovtadmor等[16]最先用emS诱变构建了甜瓜品种noyYizreel的突变基因库，共产生3000个m2家系，发现了大量新的表型突变，大部分为隐性单基因控制。FatimaDahmani-mardas等[17]建立了甜瓜品种Charmono（CucumismeloL.subsp.melovar.cantalupensis）的tiLLinG技术平台，Charmono系雌雄同株、呼吸跃变型，在m2现了大量子叶、茎蔓、花和果实发生的表型突变，利用与果实品质相关的11个基因筛选突变株系，发现大约每隔573kb会发生一个突变，大部分都是G/C突变成a/t，也有G/C到C/G，t/a到a/t和C/G到a/t的变异，外显子测序表明31.3%为基因沉默突变，65.1%为错义，2.4%为转录终止，1.2%为拼接剪接突变，氨基环丙烷羧酸氧化酶基因CmaCo1筛选到7个独立的点突变，其中G194D果皮颜色变异明显，果实延迟成熟黄化，而果形、可溶性固形物含量和果肉颜色仍然与野生型一样。G194D自交纯合株系也呈现出果实发育期延长、果肉变硬和果实延熟，并且在2个不同试验地点表现一致，这些表型变异证明了G194D系CmaCo1基因突变而来，该研究利用tiLLinG技术成功创造了甜瓜品质新资源，显著提高了品种货架期。mireiaGonzález等[18]建立了甜瓜品种pieldeSapo（Cucumismelosubsp.melovar.inodorus）的tiLLinG技术平台，pieldeSapo系雄全同株、非呼吸跃变型，emS诱变得到2368个m2家系，用病毒侵染抗性相关的2个基因Cm-eiF4e（核细胞翻译起始因子）、eiF（iso）4e（核细胞翻译起始因子异构体）、4个与果实成熟相关的基因aCo1、Cm-noR、Cm-Det1、Cm-DHS（脱氧羧腐胺赖氨酸合酶）以及pDS（八氢番茄红素去饱和酶）筛选突变株系，发现有4个Cm-eiF4e等位基因突变，推测其中的2个改变了蛋白质功能，pDS有2个等位突变，发生在外显子的突变改变了蛋白质功能，造成了苗期白化表型突变。4个与果实成熟相关的基因在群体中筛选突变，得到8个突变的家系。徐美红等[19]用pCR产物直接测序和克隆测序2种方法用于检测这8个突变家系的碱基变化。在直接测序中，4个突变家系的测序结果清晰，能够确认碱基的变化；其他4个家系的结果不清晰，不能确认碱基的改变。在克隆测序中，8个家系的测序结果均清晰，能够直接确定目的基因的点突变。在2种方法的比较中，克隆测序的准确率、效率明显优于直接测序法。
黄瓜方面，以色列的R.Fraenkel等[20]通过emS诱变获得了大约1000个m2家系，在苗期发现了诸如植株矮化、子叶自发病变、黄（花）叶、白化苗、叶片卷曲、窄型黑色子叶等诸多表型突变，利用pDS-3（八氢番茄红素去饱和酶）筛选突变株系，发现了4个突变家系，测序表明碱基突变均发生于基因内含子区域，因此并未造成相应的黄化表型突变。该套突变体库为黄瓜反向遗传学及基因功能研究奠定了很好的基础。
西瓜作物tiLLinG技术的应用尚未见正式报道，美国农业部蔬菜研究实验室的科学家目前正在从事相关的工作，预计将很快取得进展。
3Dna芯片
Dna芯片是利用已知基因组序列，或来自未知序列的cDna克隆制备模板cDna，通过人工或特定的仪器将大量模板cDna按设计好的顺序定量地固定在载体上制备成高密度的微阵列。将标记好的样品cDna片段（来自不同细胞、组织或整个器官）与模板上的cDna进行分子杂交。根据不同材料间基因差异表达的信息，推论某个基因的功能或鉴定和分离目的基因。Dna芯片还广泛应用于基因表达谱、突变基因筛选和转基因鉴别等方面。
在西瓜上，Levi等[4]通过与叶片cDna消减杂交构建了西瓜果实发育不同时期（授粉后12、24、36d）果肉消减cDna文库。为进一步探究这些eSt-unigenes在果实发育不同时期的转录表达差异，w.patrickwechter等[21]利用微列阵（microarray）技术对这些eSt进行了差异表达分析，发现与叶片相比，有335个eSts的表达存在明显的差异，表达量差异至少在2倍以上。其中有211个与已知功能基因同源，96个为未知基因。这些基因参与了维管系统、类胡萝卜素合成、转录调控、病原和逆境胁迫响应以及乙烯合成等，实时定量pCR也验证了这些功能基因的差异表达。
在甜瓜上，张红等[22]利用国内首个甜瓜cDna芯片meloncDnaarrayver1.0检测了新疆厚皮甜瓜（Cucumismelovar.ameri）果实基因表达以及经60Co射线辐射诱变后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病变异株成熟果实基因的表达。结果显示，该芯片平均能够检测新疆厚皮甜瓜基因2008个，检测出的基因占该芯片基因探针总数的65.4%。发现酸味抗病变异株上调表达的基因有251个，占检出基因总数的12.5%，下调表达的基因224个，占检出基因总数的11.16%。Rt-pCR重复试验表明用meloncDnaarrayver1.0检测新疆厚皮甜瓜成熟果实基因表达水平是可行的。DanielGonzalez-ibeas等[23]利用抗西瓜花叶病毒甜瓜材料tGR-1551，感病材料tendral，用Dna芯片检测了17443个unigenes的表达，发现接种感染后tGR-1551比对照发生了显著的转录差异，与空白对照相比，tendral有3291个unigenes差异表达，tGR-1551有2488个unigenes差异表达，共有677个unigeneunigenes受到抑制表达。说明tGR-1551发生了广泛、深刻的转录差异。
在黄瓜上，毛伟华等[24]通过GenBank搜索已的生物代谢途径中的关键酶基因序列，设计特异性引物，采用Rt-pCR法扩增这些酶的相应基因片段，在完成432个基因片段的克隆分离、测序和生物信息学分析工作的基础上研制出国内首张黄瓜cDna芯片。该芯片含有9个质控cDn段和423个cDna探针，涉及光反应、卡尔文循环、碳水化合物代谢、水-水循环、信号传导、激素代谢、光呼吸、防御、蛋白与氨基酸代谢等多个代谢途径。利用该芯片对黄瓜缺镁胁迫下基因表达谱进行了初步研究，发现在缺镁胁迫下差异表达的22个基因，其中10个基因的表达受缺镁处理抑制，12个基因的表达受缺镁处理诱导。该芯片的研制为进一步研究黄瓜功能基因的高通量时空变化提供了有效的技术支撑。为验证该套cDna芯片杂交结果的可靠性，毛伟华等[25]研究了黄瓜在CmV侵染胁迫下的基因表达谱变化，并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量pCR（QRt—pCR）进行检测，共获得67个差异表达显著的基因，其中42个基因下调表达，25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径，许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制，而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导表达。同时，也发现了一些与CmV胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究发现，CmV胁迫引发了黄瓜代谢发生一系列复杂的适应性变化，pR1-1a等基因可能在黄瓜防御CmV侵染过程发挥着重要作用。
4Rnai技术
Rnai（Rnainterference）是一种双链Rna（double-strandedRna，dsRna）分子在mRna水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，ptGS）。Rnai技术具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变体，根据表型变异可推测该基因的功能，Rnai已发展成为功能基因组学研究中基因功能鉴定的一种强有力的工具。
2012年，anam.等[26]利用Rnai技术沉默甜瓜Cm-eiF4e（核细胞翻译起始因子）基因，通过对转基因t2代接种8种甜瓜易侵染的病毒，发现转基因植株对黄瓜叶脉黄化病毒（CVYV）、甜瓜坏死斑病毒（mnSV）、摩洛哥西瓜花叶病毒（mwmV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYmV）产生抗性，表明Cm-eiF4e的存在造成甜瓜对这4种病毒的易感染性。Cm-eiF4e基因对于甜瓜作物广谱高抗等位基因的发现，将是一个有效的选择途径。程鸿等[27]通过Rt-pCR方法从甜瓜中克隆得到白粉病感病相关基因CmmLo2的cDna序列，Rt-pCR结果表明，CmmLo2主要在甜瓜叶片中表达，具有组织特异性。在受到白粉病菌胁迫时CmmLo2表达显著上调，表明CmmLo2很有可能与白粉病发病有关。构建Rnai表达载体，利用叶盘转化法转化甜瓜，获得了pCR阳性植株，对白粉病接种鉴定结果表明，转化植株对白粉病具有抗性，证明通过ihpRnai敲除CmmLo2，可以获得对白粉病具有抗性的甜瓜材料。
5t-Dna插入突变
t-Dna（transferredDna）是根癌农杆菌（agrobacteriumtumefaciens）内ti质粒（tumor-inducingplasmid）上的一段Dna，它能侵染并稳定地整合到植物基因组中。由于插入的t-Dna序列已知，插入到植物基因组中的t-Dna类似于给基因贴了一个序列标签。通过分离t-Dna标签位点的侧翼水稻基因组序列，可以快捷地找到含有标签的基因，经过插入标签基因与突变体表型的共分离检测，从而获得基因的生物学功能。任海英等[28]采用农杆菌侵染子叶外植体的方法产生t-Dna插入的甜瓜突变体，筛选到一个蔓枯病抗性明显增强的突变体，命名为edr2，该突变体是t-Dna单拷贝插入甜瓜染色体引起的，edr2的蔓枯病抗性和标记基因卡那霉素抗性基因共分离。蔓枯病菌在突变体甜瓜edr2上的侵染过程与在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌发率降低、芽管的伸长和菌丝的生长较迟缓。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突变体发生细胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的细胞发生程序性死亡。本研究为选育抗蔓枯病的甜瓜品种提供了新的思路，为挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。
6展望
西瓜[29]、甜瓜[30]、黄瓜[31]全基因组测序已完成并对外公布，测序获得的大量生物信息为开展功能基因组学研究奠定了基础，也标志着瓜类作物基因组研究逐步进入到功能基因组研究时代。可以预测，未来将会有更多不同类型的cDna文库，包括全长cDna文库被构建，更多的eSt序列将被释放，从而为基因芯片的开发提供更多的源序列。另外，tiLLinG、t-Dna突变体库的构建工作也将陆续启动或完成，更多的功能基因将被鉴定和分离。功能基因组研究的深入有望鉴定和分离出控制重要农艺性状的全部基因，揭示基因的时空表达模式，弄清在性状形成中基因与基因的互作，并在此基础上形成对基因调控网络的认识。届时人们就能够从基因结构和基因表达调控两个方面对基因进行修饰，在作物育种实践中实现分子设计育种，从而培育出抗逆性强、品质优良、有益人体健康的西瓜、甜瓜、黄瓜品种，满足人们不断增长的消费需求。
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基因组学研究篇3
论文摘要土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法，是研究土壤微生物生态学的基础，也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。介绍了土壤宏基因文库的构建、筛选及土壤宏基因组研究现状和这一技术的局限性。
宏基因组学源于20世纪70年代土壤微生物基因组dna的直接提取技术的实现，随着微生物学和生物技术的不断发展，handelsman于1998年提出了宏基因组学的概念[1]。宏基因组学又叫环境基因组学（environmentalgenomics）或群体基因组学（communitygenomics），定义为利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的有机体群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。生物学和化学的结合孕育了宏基因组学的诞生，而宏基因组学的发展需要最大限度的利用现代生物技术和实用筛选技术。
土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法[2]，这种方法从土壤环境样品中直接提取微生物基因组dna（宏基因组）并克隆于不同载体，再将重组载体转移到适宜的宿主以建立宏基因组文库；同时结合不同的筛选技术，从基因文库中筛选新基因或新的生物活性物质。应用这些免培养的新方法和新技术，可以绕过微生物菌种分离培养这一技术难关，直接在基因水平上研究、开发和利用无法培养的微生物资源；有利于揭示不可培养微生物的基因多样性，为农业、医药和环境的可持续发展提供丰富的资源。
1土壤宏基因文库的构建
关于土壤宏基因组学技术的构建已有许多研究报道[3]，文库的构建需要足够高质量的dna，由于土壤微生物往往会与土壤其他组分紧密结合，这就增加了提取土壤dna的难度[4]。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，使其释放dna，继而抽提纯化；间接提取法是首先去除土壤等杂质，通过不同的离心速度从土壤中分离出细胞，然后对细胞进行抽提。直接提取法提取的dna片段较小（1~50kb），提取率高，操作简单；间接提取法提取的片断较大（20~500kb），纯度高，但操作繁琐，有些微生物在分离过程中会丢失。
根据插入片断大小，可以把基因文库分成2类：质粒载体的小片段插入（小于15kb）和柯斯质粒（15~40kb）或bac（细菌人工染色体）（超过40kb）载体的大片段插入。大肠杆菌（escherichiacoli）是表达土壤细菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭载体或bac文库可将大肠杆菌包含的文库信息转移至其他宿主如链霉菌或假单胞菌[5]。
载体系统的选择取决于所提取土壤dna的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严重的dna样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子；而对于含较大基因簇或大片段的dna样品则需要构建大片段和大容量的载体文库。rondon直接把环境dna克隆到低拷贝bac载体，以大肠杆菌作为宿主构建了含100mbp的小文库（sl1），
并从这个文库中检测到dna酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。
2土壤宏基因组文库的筛选
宏基因文库的筛选主要有功能驱动筛选、化合物结构水平的筛选、序列驱动筛选，底物诱导基因表达筛选。功能驱动筛选是根据重组克隆产生的新活性进行筛选，在工业上有很多重要的酶就是用这种方法发现的。其主要缺点是要在寄主中进行功能表达，造成筛选工作量大，效率低。化合物结构水平的筛选是根据不同结构的物质在色谱中有不同的峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子。此方法工作量大，费用高。序列驱动筛选是不依赖重组基因在宿主中表达来筛选，而是根据已知功能的基因序列设计探针或pcr引物，通过杂交进行筛选具有目标序列的克隆子。底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选，这种方法已经成功的从宏基因中筛选出芳烃化合物诱导的基因。国内外的资料显示这4种筛选方法可以筛选到所需要的物质，但筛选效率低，费用高。
3土壤宏基因组研究现状
利用宏基因组学的技术，科研人员筛选到了许多功能基因，加拿大terragendiscover公司最先在以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到了具有抗菌活性的5种新的小分子物质terraginea、b、c、d、e[5]；courtois等利用柯斯载体构建了含5000个克隆子的环境基因组文库，采用pcr序列分析的方法，筛选出编码聚酮合成酶的新基因，同时采用hplc技术发现了脂肪二烯醇中2种新的化合物，两者互为同分异构体；yun等选用puc19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库，利用活性筛选方法，从30000个重组子中筛选出1个含淀粉酶基因（amym）的克隆子。
2005年，limhk等以枯草芽孢杆菌为宿主，建立了森林土壤的宏基因组文库，筛选到2个具有抗菌活性的克隆，对其结构进行分析，得出其中一个为产红素的靛玉红，另一个为产蓝素的靛蓝，是靛玉红的异构体。2006年，vogets等首次研究了从土壤宏基因组文库中筛选到的一种纤维素酶的性质，证实了其具有较广的ph值和温度适应范围，并且在较高的盐度时也具有活性，具有工业应用价值。
4土壤宏基因组学的技术局限性
总dna提取技术尚存在一定的限制，土壤环境中，由于微生物与土壤颗粒紧密结合的特性以及腐殖酸等抑制性物质存在等原因，从中难以获得适于构建宏基因组文库的高分子量dna。bertrand等采用间接提取法，通过nycodenz梯度离心，所回收的土壤dna片段大小己能达到400kbp，但至今基于原位裂解获得>100kbp土壤dna的提取技术尚未突破，运用原位裂解法构建更大片段环境宏基因组文库（现有的土壤宏基因组文库中，平均插人片段最大为44.5kb）仍是一个难点。不可避免地，环境宏基因组文库所包含微生物基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象发生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，却在测序量高达1.6gbp的马尾藻海水宏基因组文库中被遗漏，表明仅运用宏基因组学技术同样会忽略部分的微生物资源。
阳性克隆筛选频率低是宏基因组学的另一个瓶颈所在，运用经典的功能筛选方式，往往是在数千个，甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆，造成此局面一个重要的原因是外源基因的异源表达水平低下。目前根据核酸序列相似性及基因保守区设计探针或引物的杂交、pcr筛选方法，从文库中发现新基因的比率尚不到已知基因的40%。
环境微生物宏基因组研究能让我们发现存在于不可培养微生物中的一些重要的生理过程。许多实验室已经开始努力从不可培养土壤生物的基因组序列中去获得重要的基因，特别是从acidobacterium组中，因为它是土壤中最常见的细菌。这些数据提供了关于这些生物在土壤中扮演角色的线索。随着足够序列信息的获得，这些生物的代谢途径将被构建出来，引导我们采取有效的策略去培养这些生物。这些数据也将准许我们构建包含所有已知开放阅读框的微生物芯片，来确定这些基因在时间和空间上的表达状况。
尽管宏基因组技术本身还存在着一些局限性，但它为土壤微生物的研究提供了一种有效的研究策略，尤其是对于99％以上不能获得纯培养的土壤微生物来说，宏基因组学不仅是研究土壤微生物生态学的坚实基础，更是我们获得土壤中各种基因资源的一个有效手段。
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基因组学研究篇4
【关键词】脂肪移植；缺氧诱导因子-1α(HiF-1α)；二氯化钴(CoCl2)；缺氧预适应
StudyontheexpressofHiF-1αproteinandHiF-1αmRnaafterinjectedCoCl2
LianGJie,penGJun-qiang,penGZhi,etal.DepartmentofplasticBeauty,affiliatedHospitalofGuangdongmedicalCollege,Zhanjiang524001,China
【abstract】objectivetoinvestigatewhetherhypoxiapreconditioningexistinadiposetissue,andconstructthehypoxemicmodelofadiposetissue.methodsafterinjecteddifferentdensityCoCl2torat’ssubcutaneouslyofgroin,useimmunohistochemicalmethoddetectHiF-1αprotein，anduseRt-pCRdetectHiF-1αmRna.ResultsafterinjecteddifferentdensityCoCl2,theadiposetissueofrat’sgroinexpressdifferentdegreeofHiF-1αproteinandHiF-1αmRna.,andreachthepeakwhenthedensityis20-40mg/kgandthetimeis3h.ConclusionHypoxiapreconditioningexistinadiposetissue,andtheeffectofpreconditioningismostevidencewhenthedensityis20-40mg/kgandthetimeis3h.
【Keywords】Fattransplantation；Hypoxia-induciblefactor1α(HiF-1α)；CoCl2；ischemicpreconditioning(ip)
自体脂肪组织作为理想的软组织填充材料，具有生物相容性好，且没有免疫排斥反应，来源丰富等优点。但研究发现移植的脂肪颗粒，在体积和质量上减少30%~60%，甚至更多，且坏死的脂肪颗粒会引起纤维囊性化和假性囊肿[1]。目前提高脂肪组织游离移植成活率的研究主要集中于促进移植体血管生成，但不能在脂肪移植体血供恢复之前减少脂肪组织的坏死和纤维囊性化。80年代组织学的研究表明，在脂肪游离移植后10~20d才有真正意义上的血管生成，此10~20d为移植脂肪存活的窗口期[1,2]。提高脂肪组织在窗口期对缺血缺氧的耐受力是移植脂肪存活的关键。研究表明缺氧预适应可以提高多种组织对缺血缺氧的耐受力。
1材料和方法
1．1动物及分组清洁级雌性SD大鼠72只，月龄2个月，体质量(20±20)g(由广东医学院实验动物中心提供)；按随机数字表法分成9组；按量效关系分5组，分别对应0mg/kg组、5mg/kg组、10mg/kg组、20mg/kg组、40mg/kg组；按时效关系分5组，分别对应1h组、3h组、6h组、12h组、24h组。其中量效关系20mg/kg组与时效关系6h组重合。
1．2缺氧模型的构建碘伏消毒后沿右侧腹股沟从内下到外上在皮下层作均匀的局部浸润注射CoCl2，注射后行轻柔按摩。按设计在注射后一定的时间切取右侧腹股沟区脂肪，取下脂肪约3～4ml。
1．3指标检测免疫组织化学法(SaBC法)检测HiF-1α蛋白表达情况,40倍物镜下取相互不重叠的4个视野，应用显微图像分析仪，测定HiF-1α蛋白阳性反应物的平均面密度值；Rt-pCR法检测HiF-1αmRna的表达情况，扩增HiF-a基因的上游引物的序列为：5’-aaGtCtaGGGatGCaGCa-3’，下游引物的序列为：5’-CaaGatCaCCaGCatCatG-3’(175bp)。pCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火45s，循环30次后72℃延伸10min。
1．4统计学处理数据采用SpSS11．5forwindows统计软件包处理，所得数据以均数±标准差(x±s)表示，各组均数的比较采用方差分析，组间比较用SnK法，p
2结果
免疫组织化学的结果显示阳性表达位于脂肪细胞细胞核和部分包膜上。HiF-1α蛋白阳性细胞密度比较和pCtβ-actin积分密度值比较结果如下。
2．1浓度组见表1，0mg/kg组可检测到少量HiF-1α表达，5mg/kg组、10mg/kg组HiF-1αmRna表达出现或升高,20mg/kg组、40mg/kg组表达升高显著。SnK组间比较显示：5mg/kg组、10mg/kg组与0mg/kg组比较差异无统计学意义(p>0．05)，20mg/kg组、40mg/kg组与0mg/kg组比较差异有统计学意义(p0．05)。
2．2时间组20mg/kg浓度CoCl2行化学缺氧后1、3、6、12、24h均有HiF-1α阳性细胞表达。SnK组间比较显示：3h组表达达高峰，12h组、24h组均下降。3h组、6h组和1h组比较差异有统计学意义(p0．05)，见表2。
3讨论
用不同浓度CoCl2于大鼠腹股沟区皮下层作局部浸润注射行化学缺氧后该区脂肪组织在不同时间有不同程度HiF-1α的表达。HiF-1α是氧调节蛋白，为HiF-1独有的亚基，它的表达决定HiF-1的表达。由HiF-1所诱导的各种基因及其产物或能增加缺氧组织的氧供和运输能力,或能降低细胞耗氧量,从而缓解氧供求之间的矛盾,以维持内环境的稳定,使机体对缺氧产生耐受与适应[3]，如Ho-1、noSs、VeGF、epo等。HiF-1α是组织缺氧预适应中最关键的产物。它的表达说明脂肪组织存在缺氧预适应，但它对提高脂肪组织游离移植成活率的作用还有待进一步研究。
有关提高脂肪组织游离移植成活率的研究，目前主要集中在促进脂肪移植体血管的生长方面。应用多种促血管生长因子、细胞，或结合多种载体进行缓释。如刘宇兰等[4]用携带VeGF的裸质粒直接在移植脂肪内注射；Yuksel等[5]将胰岛(insulin)、胰岛素样生长因子-1(iGF-1)、bFGF及其混合物引入生物可降解的聚乳酸-乙醇酸共聚物/聚乙二醇(pLGa/peG)微囊中，制成缓释剂，混合在脂肪中进行移植。杜学亮等[6]在颗粒脂肪移植的实验动物模型中应用以多聚糖酐珠为bFGF的载体；易成刚等[7]体外分离、培养人脐血中epCs，利用脂质体介导VeGF165基因转染到epCs组中，epCs整合到缺血部位新生血管中其脂肪存活率均显著高于对照组；VeGF165基因转染组与epCs组脂肪组织周边区毛细血管密度差异有统计学意义，均高于对照组。而转染VeGF165基因的epCs具有更强的促血管新生的作用。这些研究的结果表明能提高脂肪游离移植体的成活率，但不能避免脂肪组织在血供未完全恢复时发生坏死。组织学的研究表明，在脂肪游离移植后10～20d才有真正意义上的血管生成，此10～20d为移植脂肪存活的窗口期。提高脂肪组织在窗口期对缺血缺氧的耐受力是移植脂肪存活的关键[1，2]。研究表明缺氧预适应可以提高多种组织对缺血缺氧的耐受力。缺血缺氧预适应是给予机体1次或多次亚致死性的缺血缺氧性刺激，能使机体对随后的更强刺激产生适应或减轻其反应强度。murry等[8](1986年)首次用实验证明了这一现象的存在：如果患者至少有1次的前期心绞痛事件，在随后发生的长时间的缺血中，由缺血导致的损伤会减轻,并命名为“缺血预适应”(ipC)。随后越来越多的对各种动物和组织(包括骨骼肌、脊髓、肺、肝脏、肾脏、胃、小肠、脑以及内皮细胞)的研究显示[9，10]短期的缺血和缺氧能使组织从随后的较长时间的缺血中存活下来。缺氧状态诱导一系列特异性的与血管新生、能量代谢等密切相关的基因的表达，帮助自身调节和适应低氧微环境，在此过程中起关键作用的是HiF-1，它广泛参与各动物细胞中。
本组实验结果显示，用不同浓度CoCl2于大鼠腹股沟区皮下层作局部浸润注射行化学缺氧后该区脂肪组织在不同时间有不同程度HiF-1α的表达。其中，浓度组中20mg/kg组和40mg/kg组HiF-1α的表达最显著，时间中于3h组达最高。说明脂肪组织存在缺氧预适应现象。对其他组织的研究表明，缺氧预适应通过促进HiF-1等缺氧耐受基因的表达从而提高组织对缺血缺氧的耐受能力，提高组织在缺血缺氧状态下存活能力。脂肪组织的缺氧预适应可以增强脂肪移植体在移植后10～20d未有血管生成的窗口期对缺血缺氧的耐受能力，提高脂肪游离移植的存活率，但它作用的大小还需进一步研究。
参考文献
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3GeneS,akhisatoglum,KuralryF,etal.erythtopoietinrestoresglutathioneperoxidaseactivityin1-methyl-4-1,2,5,6-tetrahydropyridine-inducedneurotoxicityinC57BLmiceandstimulatesmurineastrogloalglutathioneperoxidaseproductioninvitro.neurosciLett,2002，3（321）:73-76.
4刘宇兰，张一呜，聂祝峰，等.重组人VeGF基因治疗提高游离颗粒脂肪移植存活率的实验研究.中国美容医学，2005，14(3):271-274.
5Yuksele，weinfeldaB，Cleek,etal.increasedfreefat-graftsurvivalwiththelong-termmealdeliveryofinsulin，insulin-likegrowthfactor-i，andbasicfibroblastgrowthfactorbypLGa/peGmicrospheres.plastReconstrSurg，2000，105(5)：1712-1720.
6杜学亮，罗少军，郝新光，等.碱性成纤维细胞生长因子在颗粒脂肪移植后血运重建过程中的作用.中华整形外科杂志，2005，21(2)：128-131.
7易成刚，郭树忠，张琳西，等.血管内皮细胞生长因子基因转染血管内皮祖细胞移植提高脂肪存活率的实验研究.中华整形外科杂志，2005，43(11)：730-735.
8murryCe,JenningsRB，ReimerKa.preconditioningwithischemiaadelayoflethalcellinjuryinischemicmyocardium.Circulation,1986,74(5)：1124-1136.
基因组学研究篇5
【关键词】生物信息学宏基因组高通量测序
宏基因组（metagenome）是1998年由Handelsman等人正式提出，定义为特定生物环境中全部微生物遗传物质的总和。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的遗传物质Dna，利用第二代测序技术，得到高通量宏基因组数据，并结合微生物基因组学的研究成果，分析环境样品所包含的全部微生物的群落组成及其结构功能。高通量宏基因组数据在基础微生物学、水体、土壤、农业、医学研究等领域都显示出了重要价值[1]。
1宏基因组学研究方法
宏基因组学的研究方法主要有：环境样本的采集、宏基因组Dna的提取，高通量测序、所得序列的比对检索分析，以及进一步进行微生物物种结构和功能分析。其中，提取Dna要尽可能地提取出样品中所以微生物的基因且保持基因片段的完整，目前的提取方法主要有直接裂解法和细胞提取法。随着第二代测序技术的发展，宏基因组数据呈现出序列短小、通量巨大的特点，一方面蕴含更为丰富的环境微生物遗传物质信息，极大拓展了微生物学研究与应用领域，另一方面也为分析处理带来前所未有的挑战。
2宏基因组学的应用
在短短几年内，高通量宏基因组数据研究已渗透到各个领域，包括基础微生物学、海洋学、土壤学、医学等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值[2]。
2.1基础微生物学研究
宏基因组为基础微生物学研究打开了新局面，得以快速准确地探测新基因、发现新物种（如未知病原体等）以及准确认识微生物群落的物种构成及其功能结构。由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，其中大量微生物采样困难、培养效率低下，这极大限制了传统微生物学的研究与发展，而高通量宏基因组数据的产生则突破了这一束缚。通过分析高通量宏基因组数据，包括序列比对、Denovo组装、Go分析等等技术，无需经过提纯培养，就能探测新基因、新物种，为微生物环境工程、疾病诊断治疗奠定基础。
2.2海洋学和土壤学研究
海洋和土壤中包含大量微生物，它们与生态环境关系密切。目前通过采用土壤、海水等环境样品，获取高通量宏基因组数据，探测其中微生物的组成及功能分布，能够对导致生态环境变化的因素有更深入的认识。如利用来自海洋石油污染区的微生物高通量宏基因组数据，分析其微生物相对丰度，可以有效探测石油降解细菌及其生态关系网，为污染治理提供新思路。利用来自豆类植物附近土壤测取的宏基因组数据，分析其中固氮菌含量及其关联因素，有助于设计提高豆类产量种植模式。高通量宏基因组数据为认识复杂的微生物群落构成及其功能提供了可能，且必将在研究生物多样性和微生物环境工程中发挥重要作用[3]。
2.3医学研究领域
高通量宏基因组数据在现代医药学中扮演着极其重要的角色，一方面通过疾病样本的宏基因组分析，可以确定病原体或致病基因及其与其他因素之间的关联，为疾病治疗提供可能；另一方面利用宏基因组数据筛选在医药业中具有重要应用价值的基因及其产物，促进医药发展。如利用取自不同牙周炎病况病人口腔高通量宏基因组数据，分析处理得到各样本微生物相对丰度数据，比较不同牙周炎病况下的微生物整体分布情况，揭示出牙周炎与口腔微生物群落的生物多样性和关联网络之间有显著联系。
3结语
随着高通量测序技术的迅猛发展，宏基因组分析已经成为探索自然环境中微生物物种和功能组成的重要手段之一，是研究微生物群落的利器。宏基因组分析手段无需经过复杂严苛的实验室培养过程，直接利用第二代高通量测序技术，快速产生成千上万的自然微生物Dna序列的短读片。但是高通量宏基因组数据也给研究带来挑战。它呈现出序列短小、通量巨大的特点。此外，高通量测序技术的准确率低于传统测序技术，亟需完善的概率统计模型和有效的算法实现[4]。
在应用前景方面，随着组合生物合成技术和纳米技术迅速发展，可以考虑将宏基因组学技术与之结合，利用纳米技术人工合成由宏基因组学的方法探测所得新兴基因，促进天然活性产物的开发及挖掘，进一步促进微生物工程的发展。
参考文献：
[1]许忠能著.生物信息学[m].北京：清华大学出版社，2009.
[2]贺纪正，张丽梅，沈菊培等.宏基因组学的研究现状和发展趋势[J].环境科学学报，2008，28（2）：209-218.
基因组学研究篇6
铁皮石斛是云南省极具特色的珍稀高端药用、食用植物。2012年底，云南石斛种植面积超过6万亩（4000公顷），产值已达到30亿元。2012年1月，在云南省科技厅的支持下，云南省成立了石斛产业技术创新战略联盟，并设立专项经费开展了云南铁皮石斛地理标志研究、云南铁皮石斛质量标准研究、云南省石斛科技产业发展规划以及铁皮石斛基因组计划等课题。
作为联盟成员单位的云南农业大学联合普洱市普洱茶研究院，在中国科学院昆明动物研究所的技术支持下，以云南农业大学盛军校长（普洱市副市长）、昆明动物研究所王文研究员为课题组组长，全面展开了云南铁皮石斛基因组计划的实施。在普洱茶研究院严亮博士和昆明动物研究所董扬博士（现为昆明理工大学生命科学与技术学院教授）、王筱硕士的全力协同工作下，使用目前最新的第二代测序技术和近期刚刚引入国内的第三代单分子测序技术，用一年半时间，完成了铁皮石斛全基因组测序工作，绘制了铁皮石斛的全基因精细图谱。目前，测序深度已达铁皮石斛基因组大小的200倍，测序结果已覆盖95%的全基因组和97%的基因编码区，超过国际上同行复杂基因测序的最高水平。研究组进一步解析了铁皮石斛基因组中的基因信息，发现了48200多个蛋白质编码基因，其基因数目是目前所有已经测序的植物中最多的，从基因水平证实了铁皮石斛基因组的复杂性。
铁皮石斛基因组精细图谱的绘制完成，标志着铁皮石斛研究进入基因时代，同时也开启了国际药食同用植物基因组研究的新纪元。铁皮石斛基因组精细图谱的完成，为云南省铁皮石斛行业标准制定奠定了基础，也为中国从基因水平分析和制定铁皮石斛标准提供了科学依据。铁皮石斛的基础研究和应用开发，必将进一步加快云南石斛产业的科学发展。
该项目发起人，云南农业大学校长、普洱市副市长盛军教授指出，铁皮石斛基因组的完成，将会改变铁皮石斛产业凭经验发展的现状，为品种鉴定、基因育种、成分和功能研究以及新产品开发提供基础数据，将持续推动云南石斛产业的可持续发展。该项目的另一负责人王文研究员认为，铁皮石斛基因组将为兰科植物的起源、演化和特性研究提供基础数据，作为第一个被解析的药食同用植物基因组，也将进一步提振中药的国际知名度，促进中草药的现代化。
基因组学研究篇7
[摘要]21世纪是基因科学高度发展的世纪,针灸学可望在“后基因组时代”中发挥重要的作用。笔者认为针灸学在关键基因调控方面优势明显,针灸的作用机理研究可望通过借鉴基因科学的先进的理论与技术而有所突破,并借鉴针灸治疗溃疡性结肠炎的研究思路,提出了21世纪针灸学的研究思路与发展方向。
[主题词]针灸学;研究设计;基因组,人GeneScienceandacupmoxibustionScienceofthe21thCenturywuHuangan,ZhangBimeng,LiuHuirong(
Shanghaimunicipalinstituteofacupmoxibustionandmeridians,Shanghai200030)[abstract]the21
thcenturywillbeacenturyofhighdegreeofdevelopmentingenescience.acupmoxibustionsciencemay
playanimportantroleinthe“latergenometimes”.theauthorsholdthatacupmoxibustionsciencehaso
bviousadvantagesinregulationofcriticalfunctionalgenes;studiesonmechanismsofacupunc
tureandmoxibustionmayhavesomebreakthroughbymeansofadvancedtheoriesandtechniqueso
fgenescience.theyalsoputforwardresearchthinkinganddevelopmentdirectionofacup
moxibustionscienceinthe21thcenturybasedonthinkingofstudyontreatmentofulcer
ativecolitiswithacupunctureandmoxibustion.
[Keywords]acupuncturemoxibustionScience;ResearchDesign;Genome,Human第一作者简介:吴焕淦,男,上海中医药大学教授、博士生导师,上海市针灸经络研究所副所长。
作为生命科学的重要组成部分,针灸学在现代化研究进程中,充分吸收、借鉴了生命科学领域的新思维、新理论、新技术,在针刺镇痛机理研究,经络、腧穴本质探讨方面取得了一系列进展,针灸与神经、内分泌、免疫系统相关性研究成果也已为医学界所认同。我们也意识到,有关针灸作用机理研究和其他与针灸学发展密切相关的问题,不是针灸学本身所能解决的,只有将其融入生命科学这一大环境中,针灸学才能获得进一步的发展。可以预测,在到来的21世纪里,生命科学必将获得空前的发展,“基因科学”将渗透到医学的各个领域,在新的“基因时代”里,针灸学将受到哪些影响,它的发展前景如何?我们应该如何把握这一发展时机等一系列相关问题,应引起每一位针灸工作者的足够重视。结合我们课题组在长期从事针灸免疫(包括分子免疫学)相关研究过程中所积累的一些经验,从以下几个方面提出一些初浅的看法。
1基因组学快速发展
自20世纪以来,生命科学获得了极大发展,特别是1953年Dna双螺旋结构的发现以及1985年Crick的遗传信息传递的中心法则的提出,更是极大地促进了基因组学的发展,从而引发了一场世界范围内的基因技术革命,它对整个社会的影响是巨大的,在工业、农业、环保、医药等方面显示出广阔的发展前景。基因组学的研究可分为两个阶段:一是以人类基因组Dna的全序列测定为标志的“结构基因组学”阶段。自美国从1990年启动人类基因组计划(HGp)以来,已经发展成为一个国际大协作项目,它的意义可与曼哈顿原子弹计划及阿波罗登月计划相媲美,但现阶段HGp的完成仅为今后全面认识人类基因组的功能提供了一个结构基础[1]。随之而来的是竞争更为激烈的“后基因组时代”,为了确保我国在未来的生命科学中占有重要地位,我国确立了从“功能基因组学”和“疾病基因组学”入手的研究策略,同时,也认识到人类基因组学的研究方法、研究内容与中医学的整体观、辨证观有许多相似之处,中医药(包括针灸)在这方面有巨大潜力。
2针灸学的优势
针灸是在中医的脏腑经脉等相关理论的指导下,通过针刺或艾灸来达到调整脏腑的阴阳气血、虚实正邪等,最终起到治疗作用。它擅长从整体上对人体进行调整,并可根据机体不同的功能状况,通过选用不同的穴位或采用不同的针刺手法来达到调整机体功能状态之目的。针灸学作为中医学的重要组成部分,其基本治疗思想是将疾病的病理过程作为一个整体,它通过影响多靶点和疾病过程的多个环节,从而激发机体自身内在的调整能力来达到治疗目的[2]。其整合作用不仅表现在影响疾病的病理过程,对体质改善也有作用,在解决疾病易感性方面优势明显。当前,人类的疾病由以感染和营养失调为主的单因素疾病转向以机体自身代谢和调控失常为主的多因素疾病,以对抗为主要特征的西医未能达到从根本上改变复杂的病理过程,难以遏止疾病的发展[3]。虽然基因科学带给医学的影响是巨大的,甚至被称为“基因科学导致医学革命”,许多科学家也提出可以用改变基因结构来治疗单基因疾病,但这只是理论上的设想,迄今为止,基因治疗尚不成熟,它的负面效应还不清楚[4]。况且,绝大多数发病率高、危害性大的疾病是多基因疾病,是有多个调控基因失常所致,因此,治疗策略应该是以修饰或调控基因表达与基因产物功能来达到治疗目的。在研究基因组过程中,认识到多种致病因素作用于人体,能否发病以及预后情况怎样,是疾病相关基因与内外环境相互作用的结果,外因是通过内因起作用的,并在此基础上提出了诊治的个体化等新的治疗观念,这与中医学(针灸学)的辨证论治观相一致。针灸学在整个发展过程,都贯穿着辨证论治思想,其以多环节、多靶点的整合调节为特点,在治疗与病种方面的优势依然明显。基因组学与中医针灸学在思维方法学上的趋近性,为两者在研究思路与研究方法的相互渗透提供了可能。
3基因芯片在针灸治疗溃疡性结肠炎作用机制研究中的应用
有关针灸作用机理的研究,古代及近代医家都作过探索,但基本上停留在以传统的中医理论进行阐述。近半个世纪以来,国内外学者在针灸作用机理研究,如针刺镇痛机理的研究,针刺对神经、免疫、内分泌系统调节的研究等方面,均作了大量细致而有意义的工作,并证实了针刺的确切疗效,但尚缺少被人们普遍接受的合理解释。针灸治疗溃疡性结肠炎临床与机理的系列研究所提供的研究思路,对我们颇有借鉴意义。溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis,UC)属难治性疾病,病因涉及免疫系统、环境,以及尚未确定的慢性肠道炎症易感基因之间的相互作用。这些相互作用引起一系列级联改变,导致慢性肠道炎症、组织病变和疾病。我们的研究发现:隔药灸治疗UC不仅具有满意的近期疗效,也有一定的远期疗效,且副作用小[5]。有关隔药灸治疗UC的临床及作用机理的研究成果已得到学术界的广泛认同:(1)艾灸治疗溃疡性结肠炎的形态学研究(SCi收录)[5];(2)从细胞因子与基因调控探讨针灸治疗溃疡性结肠炎的机理(SCi收录)[6];(3)针灸治疗大鼠溃疡性结肠炎分子免疫学机理研究[7],发现隔药灸与电针能够上调溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜中iL1ramRna表达,降低iL1βmRna、iL6mRna表达及inoSmRna的表达,从而有效地控制溃疡性结肠炎已启动的炎症和免疫级联反应[6、7]。上述研究成果为进一步从基因表达调控水平上研究UC提供了理论及实验基础,也为研究隔药灸调节相关基因表达及表达产物功能提供了重要依据。但这种只针对单基因的研究思路对揭示UC的发病本质存在一定的局限性,毕竟众多细胞因子之间及其与靶细胞之间是相互影响、相互作用的。
国外有研究选择性删除小鼠一个感兴趣的基因(或称为“敲除”)而产生慢性肠道炎症。特发性肠道炎症可以是免疫系统特异基因异常的结果,在这些有基因改变的动物,正常肠道菌群能诱发慢性肠道炎症。但对各种溃疡性结肠炎“敲除”突变体模型的思考,强烈支持环境(在这里指肠道菌群)可能与特异基因(特别是那些上调或下调免疫系统者)相互作用而引起溃疡性结肠炎的设想[8]。但无论在生理或病理条件下,在基因表达调控、机体免疫及细胞分化等重要生命活动中,并非每个基因都是单独的发挥作用,众多基因是作为一个统一的整体进行调节的。目前,国内尚缺乏全面、深入的相关研究,未能阐明溃疡性结肠炎的确切发病机理,这给有效的治疗该病带来了困难。因此,筛选在影响UC的多个环节上起作用的分子和起关键性调控作用的基因,从基因的整体调控水平来揭示溃疡性结肠炎的发病机制及针灸治疗的可能作用机制应是医学界所关注的问题。
借鉴生命科学领域先进的理论与方法,应用近几年发展起来的前沿生物技术―――基因芯片技术筛选出UC差异表达基因及隔药灸“天枢穴”治疗UC的反应性基因,并克隆部分未知基因全长cDna,进行功能分析,初步建立“UC相关基因表达谱”,阐释UC的发生机制与隔药灸治疗UC的基因调控和功能修饰的机制,探讨能与隔药灸起反应的基因。这些基因可能是目前已知的与UC相关的基因,也可能是未知功能的基因,国内尚未对溃疡性结肠炎基因表达谱有一个全面的认识。因此,从整体水平出发来研究针灸的基因表达谱为最终揭示针灸的作用本质提供了可能,同时也为针灸的现代化研究提供了一种很好的思路。
自人类基因组计划实施以来,不仅给现代医药学带来新机遇,也为针灸学的发展带来了极好的契机。国内一些学者已注意到在“功能基因组”与“疾病基因组”的调控方面,针灸具有巨大的潜力,并且意识到如果在这方面的研究有所突破的话,将使我国在即将来临的“后基因组时代”处于国际领先地位[2,3]。在考虑将“功能基因组学”与针灸学结合起来进行研究时,不仅要严格遵循“功能基因组学”本身的研究规律,同时也要认识到针灸疗法本身的特点,选择针灸疗效显著的溃疡性结肠炎进行研究,因此,开展“UC隔药灸”基因表达谱的相关研究具有较高的理论与应用价值。
实践证明,针灸学只有采取中西医结合方式,运用先进的现代科学技术与手段,把中医基础理论的阐释、确切的临床疗效及其作用机理提供给人们,充分发挥其在调控基因功能方面的优势,才能在21世纪的生命科学研究中占有一席之地。有理由认为,只有充分地将针灸学的特色融入到生命科学的领域中,将宏观现象的研究与微观机理的研究紧密结合起来,针灸学才能在当今迅速发展的生命科学里得到丰富和发展。相信,针灸学必将在21世纪里大放光彩。
4参考文献
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7wuHuangan,etal.themechanismofinoSGenemodulationon
基因组学研究篇8
全基因组测序治疗疾病成功的案例，让千万疑难杂症患者看到了希望。全基因组测序为未来个体化医疗指明了方向。
个体化医疗走向中国
基因组时代已经到来，从基因组学角度实现传统医学的转化，将有望使个体化医学用于疾病预防和治疗的不同阶段。通过基因组测序进行个体化医疗在中国也在实践中。
中国医学科学院副院长詹启敏介绍说，癌症实际上是基因组改变的一种疾病。癌症的发生发展是个复杂的过程，造成癌症的原因可以非常不同，同样的乳腺癌可能是由于不同的基因突变造成的。“只要我们能够找到标志物，也就是通过科学研究方法发现癌症形成的关键环节，找到分子靶点进行靶向治疗和个体化医疗，癌症的治愈率就会高很多。”詹启敏说。
中国科学院北京基因组研究所副所长于军说，基因分析是个体化医疗的前提，基因测序技术的发展在驱动着个体化医疗的进程。基因测序技术一直以来在支持着我国科学家进行医学研究和个体化医疗研究的发展。基因研究在我国也取得了可喜的进展。
于军介绍，从人类基因组计划开始，第一是做一个人的基因组，第二个目标是测定200个人的基因组，这个计划很多年前已经完成，现在做的是千人基因组计划，测定1000个人的基因组。“随着技术的发展，对任何群体来说1000人数量是太少了。”于军说，“在未来3~5年，会在不同的群体中测定千人到万人的基因组，通过基因组的比较找到与疾病相关的易感的变化，也可以找到一些有可能和一些疾病直接有关的位点，比如癌症的基因组改变都可能找到。”
千人基因组计划由中国深圳华大基因研究院、美国国立人类基因组研究所、英国桑格研究所等机构于2008年启动，旨在绘制迄今最详尽、最有医学应用价值的人类基因多态性图谱。深圳华大基因研究院作为“千人基因组计划”的发起单位之一，不仅承担了400个黄种人全基因组样本的测序和分析工作，还帮助完成了非洲人群的全部测序和分析任务。深圳华大基因研究院副院长王俊博士表示，“千人基因组计划”中的黄种人基因组研究，将使中国基因组科学和相关医学研究直接跨入与国际前沿完全接轨的世界先进行列，大大促进中国药物基因组学研究的发展。深圳华大基因研究院承担着国家基因库建设的工作，这将加快我国基因产业发展的步伐，加速我国个体化医疗时代的到来。
影响因素多
于军介绍，从技术上讲，全基因组测序引领的个体化医疗已经完全没有前行的障碍了，但还是需要5~10年时间才能实现。
基因组学研究篇9
天生我材做学问
董爱武教授1970年出生于吉林省，从小学习成绩优异，尤其喜爱生物和化学。然而高考那年，梦想考上北大生化系的她由于招生政策有变，最终与北大失之交臂，被吉林大学录取。尽管没有刻意选择走上科研的道路，但始终勤奋好学的董爱武似乎懵懵懂懂又注定在知识的殿堂里一步一个脚印地徐徐前行，大学毕业后，她终于还是考上了北大的研究生，专业依然是生物化学专业，天资聪明的她在求学中就这样不知不觉成了20世纪九十年代的高级知识分子。
学业有成的同时，董爱武也收获了爱情和家庭，因此虽然很多同学选择出国深造，她则在研究生毕业之后追随先生来到了上海，进入复旦大学工作，并于1999年开始攻读生物化学专业的在职博士研究生。博士期间，尤其分别在1999年、2001年和2003年到法国科学研究中心植物分子生物学研究所作访问学者，她找到了做科研的感觉和兴趣。从此，董爱武确认了自己主要的研究方向，即利用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等方法研究植物细胞分裂和生长发育过程中的表观遗传调控机制。
然而，在董爱武教授自己看来，她是勤奋的人，更是幸运的人。1999年，还是讲师的她就获得了国家自然科学基金面上项目“具有可插膜结构的新型钙调素类似蛋白的结构与功能研究”的资助，在当时，教授和副教授都很难获得自然科学基金项目的资助，因此这个项目对董爱武教授影响颇深，不但鼓舞了她做科研的信心，也激发了她做科研的热情。在接下来的几年里，她又陆续主持了自然科学基金青年基金项目“与细胞周期相关的核小体组装蛋白的功能研究”、上海市启明星计划资助项目“水稻中与染色质结构相关的功能蛋白的研究”、教育部优秀青年教师资助计划项目“水稻核小体组装蛋白的功能研究”、上海市科委重点项目“植物组蛋白分子伴侣nap家族的功能研究”、中法合作项目“植物发育信号途径中的表观遗传学机制”、自然科学基金面上项目“植物核小体组装蛋白的功能研究”等。在从事课题研究的过程中，董爱武教授乐在其中，也硕果累累，并得到学校和国家的充分肯定，2003年被评为上海市青年科技启明星和教育部优秀青年教师，2007年获得中国青年女科学家，这些荣誉让董爱武教授感到意外，同时也备受鼓舞。
探秘植物基因表达调控
了解植物的生命过程、寻找方法来控制和改变植物的生命特征，并通过对植物生长发育的基础探索，最终可促进农作物的高质高产，这正是董爱武教授的研究内容和宗旨。依托于多项研究课题，董爱武教授对组蛋白分子伴侣对染色质结构的影响、组蛋白甲基化修饰对基因表达的调控等进行深入研究，并取得了一系列实质成果。
在组蛋白分子伴侣对染色质结构的影响研究方面，董爱武教授与法国学者沈文辉教授开展了长期的合作研究。真核生物Dna的复制、转录与修复一直伴随着核小体的组装/去组装过程，该过程需要依赖核小体（染色质）组装蛋白的帮助，这类蛋白质又被称为组蛋白分子伴侣。根据与组蛋白（H3-H4）2四聚体和H2a-H2B二聚体亲和力的不同，组蛋白分子伴侣被分为两类：H2a-H2B组蛋白分子伴侣主要有nap1、FaCt等，H3-H4组蛋白分子伴侣主要有CaF-1、HiRa、aSF1等。董爱武教授实验室的研究发现：nap1与微管蛋白和细胞周期蛋白相互作用影响细胞分裂；nap1家族蛋白通过调节基因表达参与Dna的修复过程以及参与植物的非生物逆境过程；nap1相关蛋白nRp在植物根发育过程中具有重要作用；aSF1参与Dna复制及损伤修复，影响植物的多个发育过程。相关研究成果在planta、plantphysiology、plantCell、plantJournal等学术期刊发表。
在组蛋白甲基化修饰对基因表达的调控方面，作为染色质基本单位―核小体的核心组成部分，组蛋白存在多种修饰如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些修饰的排列组合就形成了组蛋白密码。组蛋白密码可以被一些特殊的调节蛋白质或蛋白质复合物所识别进而指导下游的生命活动，包括Dna的转录、复制和修复等。在此方面，董爱武教授实验室对水稻中Su（var）家族的三个成员SDG704、SDG706和SDG714的初步研究发现仅有SDG714在体外活性检测中具有H3K9甲基转移酶活性；这三个蛋白在细胞分裂的间期均定位于细胞核，但在细胞分裂期，SDG704和SDG714表现出与染色体结合的特性。董爱武教授课题组发现水稻SDG725具有H3K36专一性的甲基转移酶活性。缺失SDG725的水稻突变体表型多效，主要表现为植株矮小、剑叶夹角和种子变小等油菜素内酯（BR）缺乏的典型特征。在sdg725突变体中，大量与植物生长发育相关的基因在转录水平上发生改变，其中包括BR合成途径及信号传导途径的基因D11、BRi1和BU1。实验表明：在sdg725突变体中，D11、BRi1和BU1基因上的H3K36的双甲基化和三甲基化程度下降，同时SDG725蛋白在这些基因上的结合也明显减少，表明SDG725可以通过结合特定靶基因并对其进行组蛋白H3K36甲基化，进而促进目的基因的表达来影响水稻的生长发育。后续的研究发现SDG725还可以通过调节开花基因的表达来调控水稻的开花时间。相关研究成果在plantScience、molecularplant、plantJournal等学术期刊发表。
目前董爱武教授课题组围绕植物表观遗传学在以下两个方面展开：组蛋白分子伴侣和染色质重塑因子对染色质高级结构的影响及其在植物生长发育中的作用；组蛋白甲基化修饰及其识别对重要功能基因表达的调控及其在植物生长发育中的作用。
甘当铺路人
随着教学和科研工作的推进，董爱武教授也从助教、讲师、副教授提升为现在的教授和系主任。然而，采访中董爱武教授也表达了近几年在科研工作中遇到的困难，包括基础研究获得持续性经费资助、新知识和新技术的快速更新、科研工作与行政事务的平衡等多方面的挑战。
基因组学研究篇10
中图分类号：R245文献标识码：a文章编号：1005-5304（2014）04-0122-05
基因芯片技术是融生物学、化学、物理学、数学、计算机学、生物信息学及微电子学等多种学科技术为一体的基因序列及功能研究手段，以其高通量、大规模、平行化、集约化的技术特点，成为基因组学研究的一种重要工具。该技术能从细胞超微结构及分子相互作用来阐述生命的物质基础，从基因水平体现整体特性，进而在基因层面能很好地与针灸作用的整体性、综合性进行融合。因此，近年来，越来越多的研究者采用该技术探索针灸机理，且已取得了一定的成果。现综述如下。
1衰老
衰老是一种自然现象，其表现呈多方位。针灸作用具有整体性，有良好的抗衰老作用，对其机理的研究也是多方位、多层次的。由于衰老病因病机的复杂性，其研究模型呈多样化，并发现针灸对衰老相关基因具有良性调整作用。以D-半乳糖致衰老模型为载体研究显示，针刺涌泉对衰老大鼠的基因表达的影响主要涉及免疫、生长发育、基础代谢、细胞骨架运动及蛋白质合成[1-2]。对快速老化小鼠p10的研究表明，针灸良性调节涉及转录调节因子、应激反应蛋白、细胞信号传导、细胞骨架蛋白等老化相关基因[3]。而采用自然衰老模型大鼠研究揭示，经过针灸治疗后，血液中的炎性反应基因、蛋白质合成基因、脑老化相关基因良性表达[4]，影响抗氧化基因Sod2、txnip、Gpx3、ppif、pdliml、Clu、Cst3、atox1明显[5]；同样，脑内海马干细胞相关基因Fgf、tgf、wnt和Sox也呈良性表达，并且与针灸改善衰老学习记忆能力密切相关[6]。
2关节炎
目前研究者主要以骨关节炎与类风湿关节炎（Ra）为载体进行研究。针对骨关节炎常与肾阳虚和虚寒证密切相关的特点，研究者选择针灸治疗效果好的患者进行基因芯片检测分析。与正常人比较，肾阳虚者温针灸治疗后，作用最明显的是与免疫相关的退火素a1基因、乳铁传递蛋白基因，与基础代谢相关的Ⅱ型camp依赖性调节性蛋白激酶β链基因、热休克90kDβ链蛋白1基因，以及其他与肌肉运动、生长发育、信息等相关基因[7-8]。挑选效果最好的患者进行分析显示，变化最明显的是唾液酸黏附素基因、人类toll样受体5基因[9]。也有研究者发现，针灸治疗该病疗效好与能量代谢通路（氧化磷酸化，atp合成）、细胞信号转导通路（胰岛素信号途径、toll样受体信号途径、JaK-Stat信号途径及mapK信号途径）及细胞凋亡通路等密切相关[10]。在以Ra模型为载体的艾灸作用研究中，研究者分别从丝裂原活化蛋白激酶（mapK）信号通路和JaK-Stat信号通路进行，结果显示，与正常组比较，模型组mapK通路与JaK-Stat信号通路都异常激活；与模型组比较，艾灸组mapK通路中异常激活的Cyclina1、p38mapK、eRK1、JnK1、n-ras等相关信号分子的表达明显下调，JaK-Stat通路JaK3、Stat3、C/eBpbeta、inDo等相关信号分子表达下调，iL-22R等信号分子表达上调[11-12]。
3缺血性疾病
围绕缺血的研究主要为心肌缺血和脑缺血。对心肌缺血的研究，主要着重于针灸后心脏靶器官和脑中枢基因表达谱的变化。结果表明，针灸对心脏组织及相应脑区组织基因表达有良性调节作用，且不同针灸选穴间存在差异[13-15]。在对心脏组织研究中，与模型组比较，肺经组差异表达基因主要是免疫和炎性反应相关基因，细胞信号和传递蛋白相关基因等；心经组中主要是离子通道和运输蛋白相关基因，细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因等[13-14]。研究显示，电针通过影响凋亡加强结构域蛋白9（CaRD9）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）8和11共3个基因序列来抗心肌细胞凋亡[16]，能通过促进血管生长功能性基因表达而改善缺血心肌[17]。对中枢下丘脑脑区研究发现，与模型组比较，电针心经组涉及细胞代谢、脂质代谢、免疫反应、G蛋白偶联受体、离子转运、信号转导等[15]。对脑缺血的研究主要分为缺血前和缺血后针灸干预。针刺预处理0.5h后脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织基因表达发生变化，主要涉及神经元信号传递类（离子通道、递质、受体、第二信使）基因l1个，涉及转录调控类、代谢酶类、热休克反应类、细胞骨架类基因[18]。而发生脑缺血后，针灸也能对变化的基因起调整作用，这些基因主要涉及信号转导、细胞周期、代谢、应激反应、Dna修复等方面[19]。
4疼痛
镇痛是针灸作用的经典效应，对其机理的研究也取得一定的成果，同时也发现针灸镇痛存在明显的个体差异。为探究该现象的基因物质基础，研究者通过分析镇痛高反应组和低反应组之间的差异，发现在高反应组中，分别有353、22个基因表达上调、下调，其中最突出的是与信号通路相关基因ppYR1、CBLB、GaBRG1和ptpRF；与低发应组相比，高反应组基因变化明显的主要为CSp3和KLF5[20]；进一步分析电针镇痛有效果与无效果大鼠的下丘脑基因表达，发现差异表达基因可归入9个功能组，分别是离子转运、感知觉、突触发生与传递、信号转导、炎症反应、凋亡、转录、蛋白氨基酸磷酸化和G蛋白信号传导[21]。但也有研究表明，针灸镇痛与阿片受体、map激酶、锌指蛋白和酪氨酸磷酸化相关基因密切相关，其中存在的个体差异可能与下丘脑的离子转运功能的相关基因、谷氨酸受体和神经生长素1基因的表达差异有关[22]。
5免疫相关疾病
这类研究主要针对具体疾病和免疫细胞进行。以过敏性鼻炎患者为载体的研究表明，针灸治疗后2h、24h、4周后白细胞介素（iL）-1受体α（iL-1Rα）明显减少，且数据分析表明，针刺对该治疗可能主要是th1和th2细胞源性炎症与抗炎细胞因子平衡的结果[23]。另外，选取过敏性鼻炎患者[ph（+），ph（-）]并结合同鼻结膜炎生活质量问卷（RQLQ）评价进行研究，结果显示，ph（+）组和ph（-）组经针刺治疗后，RQLQ和基因表达都存在差异，其中变化基因主要涉及激活免疫反应、t细胞分化及细胞凋亡，且这种变化在ph（+）与ph（-）组中存在差异[24]。以自然杀伤细胞（nK）和免疫应答为对象的研究表明，电针足三里能增强大鼠脾脏中CD94、酪氨酸蛋白激酶、血管细胞黏附分子-1表达，减少蛋白酪氨酸磷酸酶和Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶-1表达，进而改善nK活性[25]。而以二硝基苯基共轭钥孔戚血蓝蛋白（Dnp-KLH）免疫小鼠为对象，发现电针能使th1（基因il12rb1、tnfaip6、nfrsf9等）、th17（基因il17d、il17rc、il23a）、阿片肽、抗凋亡相关基因上调，使th2（基因iltifb）、mapK信号通路（基因trp53、nfatc4、Rac1、Fgf13、pak1、mapk8ip2、Fgf9、Cacna2d2、prkcc、Rasgrf1、nfatc2）、凋亡相关基因下调，从而影响免疫功能[26]。
6帕金森病
帕金森的病位主要在纹状体部位。采用全基因组芯片的研究结果显示，与针灸效应密切相关的基因主要有30个，其中已知功能的有16个：Gfral、Gja4、igf2bp1、Lin9、olfr1306、olfr857、tex22、tuba8、avpr1a、Dnajb6、Glplr、ndc80、ngb、ntf3、olfr1497、Rarres2[27]。采用转录组基因芯片对纹状体基因表达分析表明，针刺治疗后12个上调基因都表现为下调，其中有11个只有针刺穴位时才下调，与对照组相比，针刺组有28个基因在针刺穴位时下调，19个基因在针刺穴位时才上调，其中与针刺效应最相关基因为Grm5、itpr1、itpr2、pde1c、pde1c、plcb4、atp2b3和Gpr156[28]。此外，对针刺后帕金森模型鼠脊髓和丘脑组织中的基因表达变化情况的研究发现，电针能使上调的基因下调，下调的基因上调，其中主要脊髓组织主要涉用细胞因子-细胞因子受体相互作用的信号通路[29]，而丘脑组织主要涉及mapK信号通路[30]。
7脊髓损伤
用改良allen’s打击法制成脊髓损伤模型进行的研究显示，电针组有181条差异表达基因，在电针组差异表达而在模型组不出现差异表达的基因共51个，影响最明显的有钙蛋白酶8、鞘氨醇激酶和趋化因子CC家族配体基因，主要涉及创伤愈合、细胞代谢、离子通道稳态、免疫和防御功能、细胞骨架蛋白和细胞外基质、细胞生长发育等[31]。另有研究者在不同时间点对脊髓损伤大鼠进行针刺，发现治疗第1日主要为睫状神经营养因子（CntF），第7日为成纤维细胞生长因子（FGF）-1、胰岛素样生长因子的1受体、神经肽Y和FGF-13，第10日则主要表现为CntF和降钙素基因相关多肽α[32]。
8溃疡性结肠炎
溃疡性结肠炎是艾灸治疗的有效病种。应用基因芯片进行结肠组织差异表达基因检测，筛选出在溃疡性结肠炎模型大鼠结肠中异常表达基因、隔药灸治疗后得到调节的差异表达基因l74条。其中，28条在溃疡性结肠炎大鼠中表达下调的基因经隔药灸治疗后表达升高；146条上调基因经隔药灸治疗后表达降低，主要涉及细胞骨架运动相关基因，如波形蛋白、前纤维蛋白Ⅱ等；免疫相关基因，如iL-1β、胰岛素样生长因子-1、DoRa蛋白等；基础代谢相关基因，如精氨酸酶1、7-谷氨酰氨转肽酶、淀粉酶等；蛋白水解酶相关基因，如明胶酶a、基质金属蛋白酶抑制因子-1、组织蛋白酶L等；炎症、感染相关基因，如结合珠蛋白、负急性期蛋白α1抑制因子3等；肿瘤相关基因，如膜相关蛋白map17、赖氨酰氧化酶、S100钙结合蛋白a9[33]。
9高胆固醇血症
针对胆固醇血症的治疗，研究选取丰隆进行针刺，并用基因芯片进行机制探索。研究发现，针刺穴位治疗诱导上调的基因涉及信号转导（ier3、tnfr6、egr1、Gdf15）、应激（Scyb2、cys-x-cys10）、细胞周期、免疫等相关基因，引起下调的基因与信号转导（nras）、转录调节（Staf）、免疫（Slpi）、细胞黏附等相关。针刺非穴位则主要引起以下基因变化：上调有代谢（adam11、Hadhsc、Uox、Slc21a6、alas1）、应激反应（Sod1、Cfh）、信号传导（Bdkrb1）、转录调控、免疫等，下调有代谢（elovl3、asns、naglu、Fpgs）、细胞凋亡（Gadd45g、Bak1）、细胞黏附、信号传导、免疫等。此外，针刺穴位变化基因还与阳性药物进行比较，显示其降脂机制可能主要与LXRα、CYp7a1、FXR基因有关[34]。
10抑郁症
研究者通过观察电针合并氟西汀对抑郁症模型大鼠海马组织基因表达的影响，从基因水平探讨针药结合治疗抑郁证机制。结果显示，电针组纠偏的基因226条，针药组纠偏的基因221条，增偏的基因9条。2组纠偏的基因均以下调基因为主，涉及凝血、炎症和凋亡相关基因等，其中电针组125条，针药组157条；而上调的基因包括蛋白质生物合成基因、嗅觉感受器和微管系统基因等。提示针药结合的优势体现在强有效地下调凝血因子V和5-羟色胺2C受体的表达[35]。
11其他
除了针对疾病外，有研究者还以芯片技术评价针刺小鼠骨骼肌后其基因的差异表达，并用反转录-聚合酶链反应进行相应的生物学验证。通过其转录调控区的生物信息学分析，发现电针作用与细胞分化、细胞增殖、肌肉修复和增生密切相关。提示电针治疗可诱导骨骼肌细胞增殖[36]。此外，还有研究者采用芯片技术从基因层面来研究比较针刺经穴、非经非穴、非针刺之间的作用差异及经穴特异性的物质基础，结果表明针刺穴位可引起某些基因表达的增强，非穴则没有明显的变化，同时还发现针刺非穴可以引起一定的应激反应[37]。而针刺足三里后，观测到胃动过速较胃动过缓明显差异表达的标志基因Hoxal、Lep、Bcl-2上调，胃动过速较胃动过缓明显差异表达的标志基因ptgs2下调[38]。
12讨论
基因表达是自然界生命过程的最基本步骤，生命将其特征信息储存在基因内，通过转录翻译等一系列生物化学过程产生种类极其丰富的蛋白质，最终实现各种生物功能。因此，从基因水平入手探讨针灸作用机制，或许能从本质上探索针灸作用相应生物事件的核心规律。基因芯片技术的高通量、敏感性的优势，使其能同时观测到某种干预后整个物质中发生变化情况，因而在针灸机理研究中具有良好的应用范围与前景。
上述研究说明，研究者在研究针灸作用对疾病的影响机制同时，还期待对针灸经典理论及针灸效应的影响因素进行揭示。相关研究也初步显示，不同经脉对靶器官的影响差异、不同经脉激活同一脑区的差异、穴位与非穴位的差异、不同的疾病及疾病模型的针灸治疗效应、针灸效果的个体差异性都具有相应基因变化，说明针灸作用存在对应的物质基础。当然，目前的研究中还存在一些问题，如大多数文献对基因芯片结果没有进行相应的生物学重复、使用的基因芯片种类存在差异、基因芯片的样本量偏小、模型制作不统一、分析方法存在差异及对基因芯片数据挖掘不够等，这些问题的解决将有助于更好地推动针灸机理研究。
应用基因芯片技术进行研究，可以筛选出海量数据，如针灸作用后可以看到许多基因发生变化，虽然这在某一角度体现出针灸作用的整体性、多靶点性，但无法体现针灸作用的多层次性。同时，对于变化的基因如何进行有效利用，哪些是针灸作用的特异性易感基因和特异性作用基因，这些基因的变化能否最终体现机体功能的变化，均是需要解决的问题。因此，如何使高通量技术为针灸研究所用，还需对这些差异基因背后的生物信息学进行更深入的分析和挖掘，如变化基因在针灸作用中的具体意义、变化基因间的相互关系等，都需要采用更进一步的方法确证，如基因敲除或基因干扰技术。此外，通过确证针灸优势效应相关基因的变化，开发筛选适合针灸治疗的优势人群将具有积极意义。
当然，单靠一种方法、一种技术是不可能把复杂的针灸理论与针灸作用机理阐述清楚的，而且，针灸作用还存在不影响基因序列表达但能通过影响机体内部环境，使基因甲基化、去乙酰化及组蛋白修饰，从而达到改善机体功能的效用。总之，在进行针灸相应的研究中，应将针灸作用的整体性、综合性与机体功能的整体性进行有机整合。其研究模式或许可为：从基因、蛋白水平层面筛选出针灸后全部变化物质变化基因之间和变化蛋白之间及各层次间网络分析找出核心基因和蛋白验证核心基因和蛋白在针灸作用中的意义明确其在机体中的意义及针灸作用靶标揭示针灸作用的核心物质基础。因此，以体现“整体性”为特征的“组学”技术无疑将更有利于针灸研究，如蛋白组、代谢组等，而作为以整体性研究为特征的一种大学科――系统生物学，也将对目前所认识的针灸机理研究产生深远的影响。
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