分子生物学研究方法篇1
[关键词]微生物分子生态学RFLpDGGeReal-timepCR
[中图分类号]Q938.1[文献码]B[文章编号]1000-405X（2015）-2-267-1
0引言
微生物分子生态学是利用分子生态技术手段研究微生物与环境之间相互关系及其相互作用规律的科学，主要研究微生物生态学基础理论问题。
1微生物分子生态学常用分析方法
1.1寡核苷酸探针检测
该方法利用目标核酸序列与特异性探针特异性互补的特点，检测荧光标记的特定Dna序列[1]。探针为一段特定方式标记的核酸序列，具有较高灵敏度。做种群鉴定时选用Dna制备探针，利用cDna避免繁琐的克隆程序，确保探针与种内全部菌株杂交。除此之外，cDna探针若具有表型特异性，则可检测某一特定表型是否存在。
1.2Dna-Dna杂交
Dna-Dna杂交针对微生物整体基因组的重组[1]，为检测Dna序列相似性提供可能性。该方法基于高温双链Dna解链、低温复性与碱基配对可转移的特点，通过温度等条件控制形成杂交Dna，检测其杂交率。由于来源不同的两条Dna单键难以配对重组，Dna杂交率可用于估计序列相似度。
1.316SrRna序列分析
该方法在微生物分类学研究中最为常用[2]。微生物16SrRna基因由保守区与可变区构成。可变区具有种属特异性，不同种属微生物间存在较大差异；保守区为所有微生物共有基因序列。微生物进化过程中，基因序列基本不变化，因此可根据保守区基因序列设计通用引物，或根据可变区基因序列设计特定引物，从而分析不同微生物的进化距离及亲缘关系。
1.4编码蛋白质基因
该方法利用基因序列控制合成蛋白质[3]。微生物代谢过程实质为生物酶催化作用下的一系列氧化还原反应，而不同功能微生物的催化反应酶具有一定特异性，因此编码功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理学方面。
2微生物分子生态学常用技术
2.1限制性片段长度多态性分析（RFLp）
在RFLp分析过程中，以所提取的微生物Dna为模版，利用特异性引物进行聚合酶链式反应（pCR）得微生物16SrRna序列，将其连接到载体，转至大肠杆菌感受态细胞，通过挑取克隆子，进而获取质粒Dna来实现克隆文库构建。不同微生物Dna序列不同，进而酶切位点不同，因此利用特异性限制性内切酶消化，可得到长短不一、数目不同的限制性酶切片段，琼脂糖凝胶电泳分离得到呈现多态性的图谱，进而获取环境微生物群落结构信息[4]。
2.2变性梯度凝胶电泳技术（DGGe）
DGGe是一种检测Dna突变的电泳技术，根据Dna在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将碱基组成不同的Dn段分开。该技术具有以下优点：①检测极限低、速度快；②结果准确可靠；③无需微生物的培养；④可同时检测多种微生物。但其存在以下局限性：无法获取样品中全部微生物Dna，而Dna回收率越低，重复性越低；不均等扩增造成结果代表性低；敏感度较低，采样和样品处理会对结果产生影响。
2.3荧光定量pCR技术（Real-timepCR）
Real-timepCR为微生物生态学研究的定量分析方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪pCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析产物，计算模板浓度。该技术具有以下优点：①利用扩增产物数量与荧光信号强度成对应关系的原理，实时检测pCR反应进程，避免了终点定量重现性差；②自动化程度高，操作安全、简单，可避免产物被污染；③检测特异性强，灵敏度与精确度高；④可实现多重扩增。其缺点在于无法对不确定对象进行分析。
3结论与展望
微生物分子生态学克服了传统培养法的不足，为全面掌握微生物多样性提供了可能。若将各方法结合，以便掌握更为全面的信息，可更好揭示微生物对环境变化的影响，预示环境变化趋势，为从微观方面改善环境提供依据。
参考文献
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分子生物学研究方法篇2
整体和局部性科学是一个复杂的知识体系，好比一块蛋糕。为了便于研究，要把它切成大、中、小块。首先切成自然科学、技术科学和社会科学三大块。在自然科学中，又有许多切法。一种传统的切法是分为物理学、化学、生物学、天文学、地理学等一级学科。近年来又有切成物质科学、生命科学、地球科学、信息科学、材料科学、能源科学、生态环境科学、纳米科学、认知科学、系统科学等的分类方法。化学是从科学整体中分割开来的一个局部，它和整体必然有千丝万缕的联系。这是它的第一个属性。
学科之间的关联和交叉如果把科学整体看成一条大河，那么按照各门科学研究的对象由简单到复杂，可以分为上游、中游和下游。数学、物理学是上游科学，化学是中游科学，生命科学、社会科学等是下游科学。上游科学研究的对象比较简单，但研究的深度很大。下游科学的研究对象比较复杂，除了用本门科学的方法以外，如果借用上游科学的理论和方法，往往可以收到事半功倍之效。所以“移上游科学之花，可以接下游科学之木”。具有上游科学的深厚基础的科学家，如果把上游科学的花，移植到下游科学，往往能取得突破性的成就。例如1994年诺贝尔经济奖授予纳什，他在1950年得数学博士学位，1951－1958年任美国麻省理工学院数学讲师、副教授，后转而研究经济学，把数学中概率论之花，移到经济学中来，提出预测经济发展趋势的博弈论，因而获得诺贝尔经济奖。
发展性化学的内涵随时代前进而改变。在19世纪，恩格斯认为化学是原子的科学（参见《自然辩证法》），因为化学是研究化学变化，即改变原子的组合和排布，而原子本身不变的科学。到了20世纪，人们认为化学是研究分子的科学，因为在这100年中，在《美国化学文摘》上登录的天然和人工合成的分子和化合物的数目已从1900年的55万种，增加到1999年12月31日的2340万种。没有别的科学能像化学那样制造出如此众多的新分子、新物质。现在世纪之交，我们大家深深感受到化学的研究对象和研究内容大大扩充了，研究方法大大深化和延伸了，所以21世纪的化学是研究泛分子的科学。
定义的多维性一门科学的定义，按照从简单到详细的程度可以分为：（1）一维定义或X－定义，X是指研究对象。（2）二维定义或XY－定义。Y是指研究的内容。（3）三维定义或XYZ－定义。Z是指研究方法。（4）四维定义或wXYZ定义，w是指研究的目的。（5）多维定义或全息定义。一门科学的全息定义还要说明它的发展趋势、与其他科学的交叉、世纪难题和突破口等等。这样才能对这门科学有全面的了解。下面以化学为例加以说明。
化学的一维定义
21世纪的化学是研究泛分子的科学。泛分子的名词是仿照泛太平洋会议等提出的。泛分子是泛指21世纪化学的研究对象。它可以分为以下十个层次：（1）原子层次，（2）分子片层次，（3）结构单元层次，（4）分子层次，（5）超分子层次，（6）高分子层次，（7）生物分子和活分子层次，（8）纳米分子和纳米聚集体层次，（9）原子和分子的宏观聚集体层次，（10）复杂分子体系及其组装体的层次。
化学的二维定义化学是研究X对象的Y内容的科学。具体地说，就是：化学是研究原子、分子片、结构单元、分子、高分子、原子分子团簇、原子分子的激发态、过渡态、吸附态、超分子、生物大分子、分子和原子的各种不同维数、不同尺度和不同复杂程度的聚集态和组装态，直到分子材料、分子器件和分子机器的合成和反应，制备、剪裁和组装，分离和分析，结构和构象，粒度和形貌，物理和化学性能，生理和生物活性及其输运和调控的作用机制，以及上述各方面的规律，相互关系和应用的自然科学。
化学的三维定义化学是用Z方法研究X对象的Y内容的科学。化学的研究方法和它的研究对象及研究内容一样，也是随时代的前进而发展的。在19世纪，化学主要是实验的科学，它的研究方法主要是实验方法。到了20世纪下半叶，随着量子化学在化学中的应用，化学不再是纯粹的实验科学了，它的研究方法有实验和理论。现在21世纪又将增加第三种方法，即模型和计算机虚拟的方法。化学的四维定义化学是用Z方法研究X对象的Y内容以达到w目的的科学。化学的目的和其他科学技术一样是认识世界和改造世界，但现在应该增加一个“保护世界”。化学和化学工业在保护世界而不是破坏地球这一伟大任务中要发挥特别重要的作用。造成污染的传统化学向绿色化学的转变是必然的趋势。21世纪的化工企业的信条是五个“为了”和五个“关心”：为了社会而关心环保；为了职工而关心安全、健康和福利；为了顾客而关心质量、声誉和商标；为了发展而关心创新；为了股东而关心效益。
化学的多维定义———21世纪化学研究的五大趋势
1、更加重视国家目标，更加重视不同学科之间的交叉和融合在世纪之交，中国和世界各国政府都更加重视国家目标，在加强基础研究的同时，要求化学更多地来改造世界，更多地渗透到与下述十个科学郡的交叉和融合：1数理科学，2生命科学，3材料科学，4能源科学，5地球和生态环境科学，6信息科学，7纳米科学技术，8工程技术科学，9系统科学，10哲学和社会科学。这是化学发展成为研究泛分子的大化学的根本原因。所以培养21世纪的化学家要有宽广的知识面，多学科的基础。
2、理论和实验更加密切结合
1998年，诺贝尔化学奖授予w．Kohn和J．a．plple。颁奖公告说：“量子化学已经发展成为广大化学家所使用的工具，将化学带入一个新时代，在这个新时代里实验和理论能够共同协力探讨分子体系的性质。化学不再是纯粹的实验科学了。”所以在21世纪，理论和计算方法的应用将大大加强，理论和实验更加密切结合。
3、在研究方法和手段上，更加重视尺度效应
20世纪的化学已重视宏观和微观的结合，21世纪将更加重视介乎两者之间的纳米尺度，并注意到从小的原子、分子组装成大的纳米分子，以至微型分子机器。
4、合成化学的新方法层出不穷合成化学始终是化学的根本任务，21世纪的合成化学将从化合物的经典合成方法扩展到包含组装等在内的广义合成，目的在于得到能实际应用的分子器件和组装体。合成方法的十化：芯片化，组合化，模板化，定向化，设计化，基因工程化，自组装化，手性化，原子经济化，绿色化。化学实验室的微型化和超微型化：节能、节材料、节时间、减少污染。从单个化合物的合成、分离、分析及性能测试的手工操作方法，发展到成千上万个化合物的同时合成，在未分离的条件下，进行性能测试，从而筛选出我们需要的化合物（例如药物）的组合化学方法。
5、分析化学已发展成为分析科学分析化学已吸收了大量物理方法、生物学方法、电子学和信息科学的方法，发展成为分析科学，应用范围也大大拓宽了。分析方法的十化：微型化芯片化、仿生化、在线化、实时化、原位化、在体化、智能化信息化、高灵敏化、高选择性化、单原子化和单分子化。单分子光谱、单分子检测，搬运和调控的技术受到重视。分离和分析方法的连用，合成和分离方法的连用，合成、分离和分析方法的三连用。
分子生物学研究方法篇3
关键词：分子生物学；技术；昆虫生态学
分子生态学是应用分子进化和群体遗传学的理论、分子生物学的技术手段、系统发生学和数学的分析方法及其他学科的知识（如地理学、古气候学等）去研究种群、进化、生态、行为、分类、生物地理演化、生物保护等学科领域的各种问题。它主要通过大量使用分子生物学先进的技术和方法，在分子水平上研究生态现象，阐明生态现象的分子机制。昆虫分子生态学就是以昆虫作为研究对象，应用分子生态学的原理与方法研究昆虫进化和适应机制的一门科学。它主要通过分子生物学的方法检查昆虫种群或个体的遗传变异，分析和解释遗传变异的特点与规律，揭示遗传变异所反应的规律性的东西，从而进一步阐明昆虫之间一级昆虫与环境之间的相互作用关系。其研究的最典型特色是运用分子遗传标记来检测研究对象的遗传变异特征，揭示昆虫的演化规律。在昆虫分子生态学研究中应用较多的分子生物学标记技术有：同工酶（蛋白质电泳）方法、限制性片段长度多态性（RFLp）方法、随机扩增Dna多态性（RapD）方法、扩增片段长度多态性（aFLp）及微卫星标记方法（SSR）及单核苷酸多态性(Snp)。其中，目前应用最多，最简便的是SSR和Snp技术。下面我们主要介绍在昆虫生态学研究中几种常用分子标记方法。
1.同工酶方法的应用
同工酶是指具有相同或相似催化功能而分子结构不同的一类酶。自从Hunter和markert创立同工酶酶谱技术后，同工酶谱的变化即可作为鉴定物种、研究分类与进化、遗传与变异的重要指标。在昆虫分子生态学发展之初，同工酶被广泛应用与昆虫的分类、种群间抗性的遗传变异等方面，随着分子生物学技术的广泛应用，同工酶技术已慢慢被淘汰。
2.RFLp技术的应用
RFLp又叫作RestrictionFragmentLengthpolymorphism.即我们所说的限制性内切酶片段长度多态性，而且他作为第一代的生物分子类标记技术，这种技术是指通过已经发现的限制性内切酶来处理不同生物个体的Dna，通过利用限制性内切酶的多种特异性来达到获得不同的Dn段的目的，这种技术一般是被应用于分子杂交，放射性同位素的显微技术中，而且也只是主要用于研究生物遗传的研究中，自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中。在昆虫生态学研究中可以用于昆虫遗传谱图的分析、遗传连锁图的构建及数量遗传性状等方面的研究。
3.RapD技术的应用
RapD，俗名是随机扩增多态性Dna技术，它是由两位美国科学家wiliams和welsh在1990年提出的，而且他们并不是研究的合作者，而是分开研究的，这种技术又被称作任意引物pCR。对于RapD来说，它所使用的物质是十分不相同的，但是对于现存的所有引发物来说，他对于在Dna序列碱基序列上的特定结合位点来说，一旦这些特异性Dna位点达到了基因组分布的扩增条件，他就会根据Dna碱基对的配位原则，完成Dna另一条链的合成。
4.aFLp技术的应用
植物基因组的aFLp中的酶切，连接和pcr问题，只要酶切出来能看到些许弥散，pcr就应该能看出结果才对，aFLp技术的关键就是把握体系的问题，每一个实验室应该有自己的一套体系，照着做一般没有问题，分子标记，就是纯体力劳动，做得很多一般就会有结果的，这是量变到质变的过程。做aFLp需要用到试剂盒，但试剂盒不如自己做省事，也没必要。除非你做的量少。但是分子标记要的就是大量重复性的劳动。因此，试剂盒不如自己做省事，也没必要，并且试剂盒中很重要的酶往往量不够用，比如t4连接酶和内切酶ecoRi，除非你做的量很少，且不需要摸索体系。酶切出来能看到些许弥散，pcr就应该能看出结果，也不一定。接头制作和连接体系也很重要，连接时间一般影响不是很大。
5.微卫星标记技术在昆虫生态学研究中的应用
微卫星标记ms是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序串联重复而成的Dna序列,其长度一般较短,广泛分布于基因组的不同位置,如（Ca）n、（at）n、（GGC）n等重复。自1981年Spritz首先在珠蛋白中发现微卫星序列到今天微卫星序列在生物学中的广泛应用,微卫星标记技术走过了近30多年的发展变化。其中，20世纪80、90年代是微卫星技术从开始到逐渐成熟的关键阶段。1982年Hamada等在研究真核生物基因组中Z-Dna形成时发现了一种新的重复因素——选择性的嘌呤-嘧啶聚合物。Jeffreys等通过对小卫星(minisatellite)的Dna指纹图谱鉴定证明了串联重复的Dna具有很高的长度差异性。与此同时，tautz等的研究表明，这种“神秘而简单冶的Dna序列是遗传变异的重要来源。1989年tautz首次应用了基于pCR的微卫星分型技术。随着微卫星分子标记的广泛使用，科研工作者对其进化、功能及在基因组中的分布等研究的了解迅速增加。近年来，微卫星分子标记也被广泛应用于昆虫学研究的各个领域。截至2012年6月，共有16396个昆虫上微卫星位点在nCBi中记录，其中双翅目、鳞翅目和膜翅目昆虫的微卫星登录数量最多，占75%。这些微卫星被广泛应用于昆虫遗传作图、种群遗传学研究、个体亲缘关系鉴定等方面。
6.Snp在昆虫分子生态学中的应用
Snp(Singlenucleotidepolymorphism)即单核苷酸多态性标记，又称单核苷酸多态性，指Dna序列中单个碱基的差别，碱基对由于排列方式不同，结合不同脱氧核苷酸对，这些核苷酸对构成密码子，密码子则以不同的排列顺序编码蛋白质，从而形成自然界多种多样的生命。Snp在基因组可以划分为两种形式：一是基因编码区的功能性突变，主要分布在基因编码区，故又称为cSnp，这类Snp较少，其变异率仅占周围序列的1/5，但因其在遗传疾病研究中具有重要意义而备受关注；二是遍布于基因组的大量碱基变异。就现在来说，Snp技术已经开始广泛用于昆虫分子生态学，包括昆虫种间鉴定，遗传图谱的分析、入侵害虫种群间亲缘关系的区分等研究。生态学的发展，Snp技术的萌芽是古人生态意识的总和，在古时，古人并不了解整个自然界，但是他们通过长期的打鱼，农牧以及狩猎积累了大量的朴素的生态学知识，比如说农作物的生长与季候的关系、常见的动物有哪些习性等等，在公园前四世纪时，希腊学者亚里士多德就曾经粗略的描述了动物有种不同的栖息地，还根据动物生活栖息地的特点将其分为了水栖和路栖，根据它的食性分成肉食和草食，还有杂食动物等等。随着人类社会的发展，人们对于生态的认识不再仅仅局限于以往的知识积累，人们通过自己的主动探究从而能够获得有关于自然界的种种知识，最后能够形成一个全面的生态学理念极其生态学系统的认知应用。本文通过描述几种技术在昆虫生态系统的运用从而得到现在科技在生态系统中的应用等等相关关系，这种应用不仅使各种技术得到提高，还对我们生态系统的探索起着极大的作用。
参考文献
[1]郭晓霞，郑哲民，于广志.同工酶在昆虫分类和进化研究中的意义[J].昆虫知识，2000，37（6）：371-374.
分子生物学研究方法篇4
关键词：研究生；课堂教学；教学方法
中图分类号：G643文献标志码：a文章编号：1674-9324（2013）36-0201-02
工科硕士研究生（以下简称研究生）的培养通常包括两个阶段：理论课程学习和学位论文研究。目前国内的状况是相对重视学位论文研究，而放松理论课程学习。原因不外乎管理不严和教师心中无底。如何提高研究生课堂教学的质量，使课堂教学能为研究生从事学位论文研究奠定基础，真正为研究生培养发挥作用，是众多从事研究生教育的导师们关心的话题。本人从事硕士研究生培养多年，承担过多门研究生课程的教学任务。在多年的教学实践中，有一些感悟和认识，也有一些经验和失误。因此，总结在此，希望与各校同仁们分享。
一、课程内容的选择
有人认为，专业知识在本科阶段已经学过，研究生阶段的教学只是“超炒冷饭”而已，这显然是一种误解。窃以为，研究生课程不能简单重复本科生的课程内容，而应“温故而知新”。知新就是学习新的知识。那么如何做到“温故而知新”呢？本人认为有两点十分重要。
首先，研究生课程应该是从深度上拓展本科的知识。一般来说，本科生阶段较注重知识的汲取。而在研究生阶段，简单的了解和汲取显然是不够的，更多的应该是钻研和探究。也就是说，本科生阶段的学习有较多“learning”的成分，而研究生教学则应更多偏重于“study”。因此，工科研究生教学负有传授知识和培养科学研究能力的双重任务，重点则应在培养研究生综合科学研究能力方面。这就要求“授人以渔”，而不是简单的“授人以鱼”。一字之差，反映了教学理念的不同。比如说，由本人承担的《多组分聚合物结构与性能》硕士研究生课程，讲述的是高分子化合物之间共混的问题。实际上，很多高分子材料专业的学生都在本科阶段学过《高分子合金》或《高分子共混》等方面的课程。那么，《多组分聚合物结构与性能》研究生课程如何上，怎样才能使研究生们从深度和广度上进一步学习相关的内容。本人觉得可以从“高分子共混物”、“高分子合金”和“多组分聚合物”之间的关系与区别出发，介绍聚合物之间的热力学相容性和工艺相容性的概念，然后剖析聚合物相容性的特点、影响因素和与材料性能的关系。这样，通过层层解剖，使学生对多组分聚合物的特点与性能有了新的认识，不再是仅仅停留在对高分子共混物的简单了解上了。
其次，通过研究生课程学习，应该使学生从广度上拓宽眼界。“硕”者，“博”也。因此，研究生与本科生对同一问题的了解，深度和广度应该是不同的。同样以《多组分聚合物结构与性能》硕士研究生课程为例。本科生阶段的学习已经了解到，各种聚合物通过共混可以获得新的特性。那么在硕士研究生课程中，需要进一步使学生了解所谓的“共混”不仅仅是物理的概念，还可以拓展到采用化学方法实现“共混”，如接枝共聚物、嵌段共聚物、互穿聚合物网络和交联共混等，而且通过这些方法得到的多组分聚合物，其性能往往更为优异。由此可引出热塑性弹性体、高性能工程材料等内容。如此步步引导，带领学生走向更深更广的科学领地。
另外，结合教师的科研工作介绍相关学科的最新发展，不仅可调动研究生的学习积极性，也为研究生下一步选择学位论文课题作好铺垫。例如，近年来碳纳米材料的研究十分红火。但碳纳米材料在高分子材料领域有怎样的表现？学生们往往是雾里看花，不甚了解。结合《多组分聚合物结构与性能》等课程的教学，让学生及时了解高分子材料对石墨烯、碳纳米管等碳纳米材料的改性，以及石墨烯、碳纳米管对高分子材料的增强、增韧作用。事实证明，这些知识对研究生日后的学位论文研究确实起了很重要的作用。
通过上述教学内容的安排，研究生们不会觉得课堂教学只是在炒本科阶段的冷饭，而是有助于逐步建立起“科学是无止境的，值得我们化毕生的精力去探索”的观念。
由此可见，研究生的理论学习阶段不是简单的知识的传授，而应看成是一名科学工作者培养的启蒙阶段。
二、教学方法的探索
本科生经典的教学方法是教师在讲台上讲，学生则边听边作笔记。由于教师和学生之间的互动性较差，往往气氛沉闷，教学效果不理想。有很多教师提倡开展课堂讨论，但对本科生而言，由于掌握的知识面不够，课堂讨论实际上很难开展。但研究生们已经经过本科的学习，掌握了大量的专业知识，因此，完全有可能通过互动的形式获取更多的知识。笔者在国外观摩过研究生的课堂教学，大多是采用小组讨论（seminar）的形式，气氛比较活跃。彼国的方法能否“洋为中用”？因此，结合研究生课程人数较少，适合开展课堂讨论的特点，本人在研究生教学中也逐步推行了seminar的形式，取得了较好的效果。
具体做法是：每一次上课教师只讲2/3时间，另外1/3时间留给学生讨论。讨论的内容在上一次上课结束时预先布置，一方面让学生有所准备，以免冷场，另一方面培养学生带着问题查找资料的习惯。一开始，学生对这种教学方式不太习惯，往往不愿意第一个发言。这时教师要适时地进行启发和引导，避免过久的冷场。实际上，往往第一个学生发言后，后面学生就会接着发言。
例如，有一次安排的讨论内容为多组分聚合物的熔体黏性流动问题。实验中发现高分子熔体的黏度要比小分子液体的大得多，但某些多组分聚合物的熔体黏度却反而变小，希望大家就这一现象开展讨论。开始学生不知从何谈起，一度冷场。我就先给大家讲了小分子流动是由于体系中存在大量与分子体积差不多大小的孔穴，在外力作用下，后面的分子填补前面的孔穴，但又留下新的孔穴，再后面的分子有可填补这些孔穴。如此前赴后继，造成了液体宏观上的流动。然后，请大家想一想，大分子流动时，是否也是这种填补孔穴式的？有同学马上回答，不可能。因为一个大分子链的体积远远大于液体中的孔穴的体积。那么大分子实现流动的最可能方法是什么呢？马上又有同学回答：向蛇一样滑行。也有同学说，滑行也不太可能，因为需要克服的分子链之间作用力太大，不太现实，有可能是像蚯蚓那样的蠕动。“滑行说”和“蠕动说”究竟哪个更合理？在课堂上马上找出答案显然不太现实，因此就将此话题留作下一堂课的讨论内容，让学生查阅文献，结合以前学过的高分子的分子运动特点，从理论上计算两个大分子之间作用力的大小。在下一堂课上，同学们将文献中的解释和自己计算的结果加以分析，得出了高分子的流动是通过链段的运动完成的结论，亦即“蠕动说”更为合理。进一步，由于两种不同化学结构的聚合物链在同一温度下的卷曲状态和运动能力是不同的，部分卷曲状态的聚合物实际上成了另一种聚合物的填充物，降低了其分子间的作用力，因此熔体黏度反而变小了。
通过这样一次活动，大家反映印象深刻。有同学说，相关的概念这一辈子恐怕也忘不了了。
三、考核方法的改革
本科生的考核大多采用笔试的方法，那是因为本科生教学的主要目的是为了掌握知识，考试则是为了考察知识掌握的程度。这套方法用在研究生身上，显然不太合适。因为如前所述，研究生的课堂教学的主要目的是激发他们的求知欲望和钻研精神，因此，考核方法也应作相应的调整。
多年来，本人一直以撰写文献综述作为考核方法。亦即要求每位研究生根据课程的内容选择一个自己感兴趣的话题，通过查阅文献写一份文献综述。为了避免学生简单的抄录，要求这份文献综述至少根据十篇以上文献综合而来，而且这十篇文献中至少有三篇是外文的原创性论文。另外，综述中不仅要对他人的研究进行总结归纳，还有加上自己的观点和见解。在撰写格式方面，应达到在国内专业期刊上发表的要求。在完成文献综述后，通常还会安排学生将自己的文献综述内容做成ppt，作一次公开演讲。这样，不但使大家更多地了解相关学科的动向，还得到了一次演讲训练的机会，收到的益处是不言而喻的。最后成绩的评定则根据研究生平时的表现、文献综述的质量、ppt的制作和演讲的能力等综合评定。
这种以文献综述代替笔试的考核方法，将简单的考察研究生对知识的掌握程度改变为对学生能力培养的一个环节，是耶非耶，尚需时间的检验。但至今为止，每年都有一部分研究生的文献综述在专业期刊上发表，说明确实达到了研究生能力培养的目的。
四、结束语
研究生教学要突出对研究生自学能力的培养，将创新精神贯穿到整个教学过程中去。教学质量的提高，需要时间的考验，不是一朝一夕可见效的。但是，培养学生是高等院校永恒的主题，提高教学质量是教师不变的追求。提高研究生教学的质量，需要我们用心、尽心，不断地探索，不断地总结。
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分子生物学研究方法篇5
[关键词]系统生物学；基因组学；蛋白质组学；计算生物学
[中图分类号]R34[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2008）09（b）-020-03
近代生物学研究主要是以分子生物学和细胞生物学研究为主。研究方法皆采用典型的还原论方法。目前为止，还原论的研究已经取得了大量的成就，在细胞甚至在分子层次对生物体都有了很具体的了解，但对生物体整体的行为却很难给出系统、圆满的解释。生物科学还停留在实验科学的阶段，没有形成一套完整的理论来描述生物体如何在整体上实现其功能行为，这实际上是还停留在牛顿力学思想体系的简单系统的研究阶段。但是生物体系统具有纷繁的复杂性[1，2]。尽管对一个复杂的生物系统来说，研究基因和蛋白质是非常重要的，而且它将是我们系统生物学的基础，但是仅仅这些尚不能充分揭示一个生物系统的全部信息。这种研究结果只限于解释生物系统的微观或局部现象，并不能解释系统整体整合功能的来源，不能充分揭示一个生物系统的信息，且忽略了系统中各个层面的交互、支持、整合等作用,限制了生物学研究的发展。在这种现状下，20世纪末人类基因组计划完成后，生物学领域的科学家都在考虑一个问题：未来生物学研究的方向在哪里？为此学术界也不乏辩论。得出的共识是：生物学的发展未来主要面对如下问题：(1)如何弄清楚单一生物反应网络，包括反应分子之间的关系、反应方式等；(2)如何研究生物反应网络之间的关系，包括量化生物学反应及生物反应网络；(3)如何利用计算机信息及生物工程技术进行生物反应，生物反应网络，乃至器官及生物体的重建。
早在1969年，BertalanfyLV就提出了一般系统理论(generalsystemstheory)，他在文章中指出生物体是一个开放系统，对其组成及生物学功能的深入研究最终需要借助于计算机和工程学等其他分支学科才能完成[3]。1999年，由LeroyHood创立的系统生物学(systemsbiology)则是在以还原论为主流的现代生物学中反其道而行之，把这种以整体为研究对象的概念重新提出。他给系统生物学赋予了这样的定义，系统生物学(systemsbiology)是研究一个生物系统中所有组成成分(基因、mRna、蛋白质等)的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。换言之，以往的实验生物学仅关心基因和蛋白质的个案，而系统生物学则要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。显然，系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学，是生物学领域革命性的方法论。以胡德的观点，基因、蛋白质以及环境之间不同层次的交互作用共同架构了整个系统的完整功能。因此，用系统的方法来理解一个生物系统应当成为并正在成为生物学研究方法的主流。利用系统的方法对其进行解析，综合分析观察实验的数据来进行系统分析。具体通过建立一定的数学模型，并利用其对真实生物系统进行预测来验证模型的有效性，从而揭示出生物体系所蕴涵的奥秘，这正是生物学研究方法的关键所在。
1系统生物学的主要研究内容
系统生物学主要研究实体系统(如生物个体、器官、组织和细胞)的建模与仿真、生化代谢途径的动态分析、各种信号转导途径的相互作用、基因调控网络以及疾病机制等[4，5]。
系统生物学的首要任务是对系统状态和结构进行描述，即致力于对系统的分析与模式识别，包括对系统的元素与系统所处环境的定义，以及对系统元素之间的相互作用关系和环境与系统之间的相互作用的深入分析。具体如生物反应中反应成分之间的量的关系，空间位置，时间次序，反应成分之间的因果关系，特别是反馈调节和变量控制等有关整个反应体系的问题等。其次要对系统的演化进行动态分析，包括对系统的稳态特征、分岔行为、相图等的分析。掌握了系统的基本演化机制，使系统具有目标性和可操作性，使之按照我们所期望的方向演化，也有助于我们重新构建或修复系统，为组织工程学的组织设计提供指导。另外，系统科学对生物系统状态的描述是分层次的，对不同层次进行的描述可能是完全不同的；系统科学对系统演化机制的分析更强调整体与局部的关系，要分析子系统之间的作用如何形成系统整体的表现、功能，而且对系统整体的每一行为都要找出其与微观层次的联系。
系统生物学的研究包括两方面的内容。首先是实验数据的取得，这主要包括提供生物数据的各种组学技术平台，其次是利用计算生物学建立生物模型。因此科学家把系统生物学分为“湿”的实验部分（实验室内的研究)和“干”的实验部分（计算机模拟和理论分析)。“湿”、“干”实验的完美整合才是真正的系统生物学。
系统生物学的技术平台主要为各种组学研究。这些高通量的组学实验构成了系统生物学的技术平台。提供建立模型所需的数据，并辨识出系统的结构。其中包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学和表型组学计算生物学通过建模和理论探索。可以为生物系统的阐明和定量预测提供强有力的基础。计算生物学包括数据开采和模拟分析。数据开采是从各实验平台产生的大量数据和信息中抽取隐含其内的规律并形成假说。模拟分析是用计算机验证所形成的假说，并对拟进行的体内、体外生物学实验进行预测，最终形成可用于各种生物学研究和预测的虚拟系统。计算生物学涉及一些新的数学原理和运算规则，需要物理和数学来研究生物学的最基本的原理，也需要计算科学、信息学、工程学等进行生物工程重建和生物信息传递的研究。
2系统生物学的研究思路及特点
系统生物学识别目标生物系统中的各种因素，然后构架一个系统模型，在其中赋予这个生物系统能动性。在此模型中研究细胞、组织、器官和生物体整体水平，研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用，并通过计算生物学来定量描述和预测生物功能、表型和行为。系统生物学最大的特点即整合。这里的整合主要包括三重含义。首先，把系统内不同性质的构成要素(Dna、mRna、蛋白质、生物小分子等)整合在一起进行研究；其次，对于多细胞生物，系统生物学要实现从基因到细胞、到器官、到组织甚至是个体的各个层次的整合。第三，研究思路和方法的整合。经典的分子生物学研究是一种垂直型的研究，即采用多种手段研究个别的基因和蛋白质。而基因组学、蛋白质组学和其他各种“组学”则是水平型研究，即以单一的手段同时研究成千上万个基因或蛋白质。而系统生物学的特点，则是要把水平型研究和垂直型研究整合起来，成为一种“三维”的研究[6]。
3系统生物学的研究方法
系统生物学最重要的研究手段是干涉(perturbation)。系统生物学的发展正是由于对生物系统的干扰手段不断进步促成的。干涉主要分为从上到下(top-down)或从下到上(bottom-up)两种。从上到下，即由外至里，主要指在系统内添加新的元素，观察系统变化。例如，在系统中增加一个新的分子以阻断某一反应通路。而从下到上，即由内到外，主要是改变系统内部结构的某些特征，从而改变整个系统，如利用基因敲除，改变在信号传导通路中起重要作用的蛋白质的转录和翻译水平[7]。
目前国际上系统生物学的研究方法根据所使用研究工具的不同可分为两类：一类是实验性方法，一类是数学建模方法。实验性方法主要是通过进行控制性的反复实验来理解系统[8，9]。首先明确要研究的系统以及所关注的系统现象或功能，鉴别系统中的所有主要元素，如Dna、mRna、蛋白质等，并收集所有可用的实验数据，建立一个描述性的初级模型(比如图形的)，用以解释系统是如何通过这些元素及其之间的相互作用实现自身功能的。其次在控制其他条件不变的情况下，干扰系统中的某个元素，由此得到这种干扰情况下系统各种层次水平的一些数据，同时收集系统状态随时变化的数据，整合这些数据并与初级模型进行比较，对模型与实际之间的不符之处通过提出各种假设来进行解释，同时修正模型。再设计不同的干扰，重复上面的步骤，直到实验数据与模型相一致为止。
数学建模[10，11]方法在根据系统内在机制对系统建立动力学模型，来定量描述系统各元素之间的相互作用，进而预测系统的动态演化结果。首先选定要研究的系统，确定描述系统状态的主要变量，以及系统内部和外部环境中所有影响这些变量的重要因素。然后深入分析这些因素与状态变量之间的因果关系，以及变量之间的相互作用方式，建立状态变量的动态演化模型。再利用数学工具对模型进行求解或者定性定量分析，充分挖掘数学模型所反映系统的动态演化性质，给出可能的演化结果，从而对系统行为进行预测。
4当代系统生物学研究热点
基因表达、基因转换开关、信号转导途径，以及系统出现疾病的机制分析等四个方面是目前系统生物学研究的主要阵地。
基因组医学(genomicmedicine)是以人类基因组为基础的生命科学和临床医学的革命。生命科学和临床医学结合，将人类基因组研究成果转化应用到临床实践中，是后基因组时代最重要的研究方向之一。人类基因组计划从完成和多种疾病相关的基因研究发现，迅速进入到蛋白质组学、染色体组和人类疾病基因的研究，通过单基因或复杂多基因疾病的相关基因研究和疾病易感因素分析，达到揭示基因与疾病的关系之目的；遗传背景与环境因素综合作用对疾病发生发展的影响；为疾病的诊断、预防和治疗、预后和风险预测提供依据。基因组医学将大大提高我们对健康和疾病状态的分子基础的认识，增强研制有效干预方法的能力。
后基因组(post-genome)的交叉学科研究是目前生命科学研究的前沿。交叉学科是一个新的研究领域，范围非常广阔，如基因组、蛋白质组、转录组等等，从而出现许多新的交叉学科。
细胞信号转导(signaltransduction)的研究是当前细胞生命活动研究的重要课题。细胞信号转导蛋白质组学是功能蛋白质组学的重要组成部分。系统地研究多条信号转导通路中蛋白质及蛋白质间相互关系及其作用规律，细胞信号转导通路网络化，其作用模式、通路、功能机制、调控多样化，细胞信号转导结构、功能、途径的异常在癌症、心血管疾病、糖尿病和大多数疾病中起重要作用。对细胞信号转导机制的了解，已成为创新药物、防病治病的关键。细胞信号转导不是一门单一学科，而是多种学科，如细胞学、生物化学、生物物理学和药理学等多学科的交叉学科。
5现阶段系统生物学存在的问题
目前的系统生物学研究还只是初步使用动力学建模方法来定量描述系统的动态演化行为，这种方法对简单巨系统是适用的，但是在运用到复杂适应性系统时就会表现出很多的局限性，有很多问题就不能解决。生物体系统的复杂程度超乎我们的想象，现阶段不宜研究整个生物体系统，可以从研究“小系统”(生物体中具有一定功能、相对独立的部分，将其看成一个“系统”)开始，当然如何正确地分析这个小系统本身也不是件易事。
5.1现有技术水平的限制
着眼于整体的系统生物学对技术、仪器的依赖性大大超过传统的分子生物学。高通量、大规模的基因组及蛋白质组等的发展都是建立于新技术、新仪器出现基础之上。就目前的技术水平来讲，距系统生物学所要求达到的理想水平还相差很远。由于技术发展的不均衡造成了系统中各个水平上的研究不均衡。基因组和基因表达方面的研究已经比较成熟，而在其他水平如蛋白质、小分子代谢物等的研究仍处于起步阶段。各种蛋白质在数量上的巨大差异是全面分析低丰度蛋白质的一大障碍。而低丰度蛋白往往是最重要的生物调节分子，如何加强对低丰度蛋白的高通量研究，将是对蛋白质组应用前景的重要保障。同样，如何研究系统内存在的非遗传性分子即细胞中存在的成百上千的独立的代谢底物及其他各种类型的大小分子，它们在基因表达、酶的构象形成等方面有着重要作用。建立适当的方法来系统检测这些分子的变化是系统生物学能否发展的关键。
5.2分析水平的限制
系统的复杂性决定了全面分析的复杂性。人类基因组计划的实施提供了庞大的信息资源，已让人眼花缭乱，而对于较核苷酸复杂得多的蛋白质及代谢物等的分析将是更大的挑战。如何系统而详尽地为公共数据库中的信息加上注解，对这些复杂数据进行储存和分析将成为系统生物学发展的瓶颈。
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分子生物学研究方法篇6
【关键词】多糖；化学；生物学；药理学；药物开发
多糖是10个以上单糖基通过甙链连接而成，一般由几百个甚至上千个单糖组成。最近一些年，糖的研究发展迅速，国内每年以发表200多篇文献的速度在积累着成果，涉及动、植等的各个领域，研究的范围涉及分离纯化、药理学以及治疗应用等[1，2]。
1多糖研究的重要性[1，3]
下面提出的几点，显示了多糖研究的重要性：①单糖、寡糖和多糖构成的糖类物质是生命存在和活动的最基本的三类物质：蛋白质、核酸和糖类之一。②机体本身的组织、细胞等到的多糖，具有双方面的功能，既是组织结构的成分，又作为身体能量的来源，同时在人体内又是很活泼的生物化学物质。③多糖中各单糖基的连接和排列是多种多样和多而繁杂的，使其可储藏巨大的信息。在总体上化学家们评价它是天才和绝妙的简明信息箱。④一个由三种单糖组成的寡糖可以产生1056个异构体，一个含有4个特定糖基的四糖在理论上可以有3万多种异构体，多糖的信息含量远远大于核酸和蛋白质。⑤医学研究的不断发展粮的化学合成、结构分析方法的进步，让较多的学者对多糖在生命活动中的传递有了新的认识。使目前对多糖及其缀合物在生命活动的调控、信号传递和辨别等方面学者们在认识上有较为统一的认识。⑥多糖对细胞的作用，主要通过激活巨噬细胞、活化t细胞、提高B淋巴细胞和nK细腻数量与活性、激活补体系统、诱生多种细胞因子等这些途径，作用于人体免疫系统。⑦近些年，通过多种降解方法，使多糖分子结构发生的改变，从而改变某些特性和功能，显著提高了活性。⑧到目前，多糖的独特免疫调节作用和几乎无毒的特性，在临床中显示出广阔的前景。其抗肿瘤、抗放射、抗菌、抗病毒等作用已广泛用于临床，香菇多糖、裂裥多糖、猪苓多糖和云芝肽糖、硫酸软骨素等受到期临床的好评。
2多糖的化学研究[1，4]
多糖的构形是多个单糖基在空间产生不同排列组合的总体结果。对多糖的多级结构的研究，能最终找出其结构和功能的关系，是深入了解多糖、改造多糖和开发利用的基础，对药物研究有极其重要的作用。由于目前的分析枝术水平还达不到相当高度，仅限于一级结构的分析。目前的分析手段主要是有化学分析、物理分析、生物分析和酶学分析。
构效分析的阐释是多糖药物学形成与建立的一个重要要素。多糖的构效关系是深入了解多糖、改进多糖、开发多糖和利用多糖的基础，也是多糖研究的难点。研究表明，一般有活性的多糖其成分多由葡萄糖果分子组成，大多具有C-6位带支链的（13）-β葡聚糖结构，多糖的活性与单糖间的甙键结合形式也有关，这种结构与其抑制肿瘤的生长有关。此外，它还具有抗细菌、抗病毒和抗凝集作用。有些多糖需要形成一定的三维空间结构才表现出活性。比如蘑菇多糖的三维螺旋结构就是其活性的先决条件，若加入尿素或二甲基亚砜，使其分子的立体结构改变，则其活性丧失。支链对活性也产生影响，将多糖进行降解，并加以硫酸化等进行分子改造，有利于生物活性的增强。多糖的分子量和它的体积有关，分子量大体积则相对增加，这种情况影响它进入人体内产生药理活性。不同的多糖产生生物学活性有一个最佳相对分子质量范围，过大和过小都不利于其作用的发挥。分了量大其具有的活性信息量相对大，但影响其发挥作用，而过小则反之。
多糖的分析、纯化是指多糖研究中获取研究对象的过程。一般包括分离、纯化和纯度鉴定三步。其中分离纯化是关键。多糖分离最简单的方法是溶剂抽提和乙醇沉淀，不同的多糖提取所用的溶剂不同。但目前用得最多的方法为水解酶消化法和稀碱提取法。大多数多糖可采用一定温度的水或稀碱液提取，尽量避免酸性条件，因会引起糖甙断裂。有些生物材料在分离多糖前，还需进行脱脂和脱色处理。蛋白酶水解法是提取氨基多糖的理想方法，蛋白酶作用的肽键范围广泛，使蛋白质充分水解。多糖的纯化就是将粗多糖中的杂质去除后而获得的单一的多糖组分，一般是先脱蛋白质后再去除小分子杂质。多糖脱蛋白常用的方法有Sevag法、三氯醋酸法等；纯化的方法有分部沉淀法、季铵盐沉淀法、盐析法和柱色谱法等方法。
3多糖生物学研究进展[3]
糖生物学是以生物大分子组成部分的糖链为研究对象，探索其作为生物信息分子在多细胞生物高层次生命活动中的功能。目前，对多糖及其缀合物在参与生命活动调控、细胞通讯和信号识别方面存在比较一致的看法。糖蛋白中的糖链通过影响蛋白质整体构象，对糖蛋白作用产生影响。它实际起免疫应答、在结缔组织中起“分子弹簧”、维持或抑制细胞生长、促进血管形成诱导轴生长以及参与信号传递等作用。
4多糖的药理学研究进展[5-7]
多糖的生物和药理研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖等作用。其他在抗衰老、降血脂、降血糖的作用方面，多糖可增强冠动脉流量与心肌供氧、降低血脂、预防动脉硬粥样硬化斑的形成。在中草药方面，人参、虫草、当归、竹荪、冬虫夏草、灵芝、猴头、银耳、黑木耳等多糖的研究证明了在这些领域的美好前景。在生化制方面，许多调节免疫因子如多种白介素、干扰素-γ等发挥了免疫调节作用，已在治疗上得到应用。而且许多研究表明，绝大多数多糖药物使用安全，几乎无毒，这是非常难得的。
5多糖药物的研究与开发[3]
国内的多糖研究，已进入临床和上市的有绞股兰多糖对失眠症的治疗，冬虫夏草多糖治疗乙肝，分枝杆菌多糖治疗支气管哮喘，枸杞多糖用于免疫调节和抗衰老，牛膝多糖用于提高人体免疫功、抗疲劳、放射治疗中提升和平衡白细胞，食用菌真菌多糖在癌症、白血病、中风中应用，胎盘脂多糖注射液临床用于抗衰老等等。国外的研究机构和公司因长期积极的研制和开发的强大力量，可以大力开发这类有前景的药物。在好几个领域如消炎、抗病毒和抗肿瘤方面处于领先的地位。目前的研究的状况是分离了不少的多糖及其缀合物，由于其纯度、空间构象不清，药物无明确的特异性分子构象，是一种非特异的治疗，疗效受到限制。美国的公司应用先进的技术完成了甘草素糖结构类似物的筛选，为人工合成新型抗炎药打下了基础。欧盟对酶抑制剂的开发，对艾滋病和乙肝的治疗有了很好的前景。随着研究的不断深入，多糖产品必将为一些疾病的诊断和治疗开辟一条有效途径，但要达到某些学者所预言的“21世纪将是糖的世纪。“还将有长长的路要走。
参考文献
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分子生物学研究方法篇7
从本质上讲，中药复方起效的物质基础是方剂产生药效的化学成分[1]。对于该问题当今存在许多不同的观点。从药效成分的数量上来看，有认为中药材中所有的化学成分都是有效成分，简称全成分论[2]，也有观点认为中药复方的疗效为其主要成分与次要成分的综合效应，即有限成分论[3]。另外，还有认为复方物质基础是复方中的少数几个成分，可以分为主要成分和次要成分，复方效应是主要成分和次要成分的综合作用，即所谓的“少数成分论”[4]。
在中医理论指导下，中药复方是根据药物的升降浮沉、归经及君臣佐使的配合，讲究各味中药间量比关系，最终达到组合效应。从现代科学的观点来分析，中药复方的组合效应实际上即指药物化学成分之间的物理效应和化学效应的总和。前者指电子之间的相互影响，使分子的极性、磁性发生变化，甚至使分子结构发生改变，从而对各种化学反应产生诱导。此外，还有能影响物质的物理性质，如溶解度降低产生沉淀；吸附作用使颜色发生改变；小分子渗入大分子或排挤大分子与其他分子的作用等等。化学效应则主要是物质之间发生化学反应，形成新物质，正是这种新成分在药效中承担主要角色，达到防病治病的目的。所以一个有效的复方，必须是在中医理论的指导下，根据药物的七情、升降浮沉、归经、君臣佐使的配伍，才会达到组合效应，那种将同类药物简单堆砌是不会达到最佳组合效应的[5]。
1中药复方物质基础研究的假说
1.1多成分系统论研究
罗国安等[6]认为中药复方是一复杂体系，起药效作用的物质基础应是广义的化学成分（广义化学成分包括无机物、小分子有机物及生物大分子三大类），中药复方依赖这些化学成分，产生协同疗效；并提出研究中药复方药效物质基础应采用“一个结合、两个基本讲清、三个化学层次、四个药理水平”（即构成中药复方的物质基础与药理作用的相互结合；讲清中药复方的化学成分，药效和作用机理；从君臣佐使药味、君臣佐使有效部分、君臣佐使有效成分3个层次进行研究。从整体动物实验、组织器官、细胞和亚细胞及分子4个不同层次的药理水平上开展药效和作用机理的研究）的研究体系，并结合现代科学技术和方法阐明复方作用的物质基础。梁逸曾等[7]认为中药复方及其制剂中化学成分非常复杂，属于多组分分析体系，提出了采用化学计量学的方法研究中药复方及其制剂。王本祥等[8]认为中药复方的药效为其主要有效成分和次要有效成分的综合效应，主要有效成分的数目类似于组成方剂的君药，仅为一种或少数几种化合物；次要有效成分的数目类似于组成方剂臣药，为几种或多种化合物；各种次要有效成分对主要有效成分的药理作用起到协同、相加等作用，最终表现出复方的临床及药理作用。
1.2二次药效学说研究
邱峰等[9]提出了中药体内直接物质基础研究的新思路，认为中药的物质基础由复杂的成分构成，由于中药多由口服进入体内，药物中的成分经过胃肠道时受到酸、碱、酶及微生物的作用，其化学结构产生了改变，包括形成新的化学成分，某些成分能够透过胃肠壁进入体内即可产生疗效，如不能通过吸收进入体内则不会产生药理效应。黄熙等[11]提出了“证治药动学”假说。该假说首先从理论与实践相结合角度论述了不仅是方剂中进入的血清成分，而且他们的药动学均是能够研究的。该假说有六要素，即复方进入体内成分：（1）能定性定量；（2）与母方效应相关；（3）数目有限；（4）之间存在新生理活性物质；（5）能产生新生活性物质；（6）能被证机体独特地处置。其中前3个要素是探明方剂药效物质基础和研究方剂药动学的先决条件。并在此基础上，提出了“方剂血清成分谱”与“靶成分”概念。方剂血清成分谱是指进入血清内的成分的结构、性质、数目、分布及其动态，吸收进入血液的成分其数目是有限的。靶成分是指血清中与母方效应相关的成分，相对于某一个药效或证效指标来讲，靶成分可以是一个或多个。该理论与中医药理论中的君臣佐使、归经、七情等理论有着密切的关系。
1.3其他方面的研究
薛燕等[13]提出的中药复方多成分经多途径协同作用的霰弹理论认为，方剂中多种成分在体内同时作用于多个部位和靶点，虽然单个成分或药物的作用并不是很强，但多种作用的相加或相乘却产生了较强的效应。
2中药复方物质基础研究进展
2.1中药复方化学物质组学的研究
化学物质组学是指一定条件下输入生物体系的所有化学物质（化学成分）组成的复杂化学体系，而化学物质组学就是研究化学物质组的组成及其相互关系的一种方法。它是在复杂的科学理论的指导下，采用层次化、系统化及逐步化的研究策略，首先强调整体有效，然后从整体到部分，弄清楚各部分之间的相互关系，在确认了有效部分后，再进一步研究有效化学物质组中各成分的相互关系，发现和确定有效成分群。常用如下方法对它们的化学特征分别进行表征：①整体化学物质组；②有效化学物质组；③有效化学成分群。如在清开灵的化学物质组学研究中，对由牛黄、黄芩、栀子、水牛角、金银花、板蓝根、珍珠母七味药材组成的复方通过多种分析表征进行了鉴定，共分析了清开灵的整体化学物质组中的40多种有机成分和10余种无机成分，能够基本讲清清开灵的主要化学组成。按照清开灵所含物质成分的性质可以分为9大类型的有效部位，即整体化学物质组可以分为9个化学物质组，并通过有效物质化学组学的研究最终确定了清开灵治疗脑缺血损伤的化学物质组的最佳配伍为4类有效组分即胆酸类、黄芩类、栀子环烯醚萜类、珍珠母提取物[14]。
2.2中药复方有效成分的研究
中药复方有效成分组的来源复杂，包括复方中原药材固有的活性成分、不同制备过程的形成产物(如pH值变化、氧化还原反应等导致不溶性复合物的生成)、胃肠道内菌群代谢产物以及肝脏代谢产物等。为此，针对中药复方有效成分组的研究形成了两条最基本的研究思路，一是基于植物药的研究方法，二是基于药代动力学原理的研究方法[15]。这种研究思路侧重于从化学切入，将提取分离作为研究的入口，提取复方中的化学成分群，再根据所研究的中药复方的临床疗效，建立与某一病症相对应的药理模型(一般为整体动物模型)和相关的药理效应评价指标。然后对复方及其各种提取分离的有效部位进行活性追踪，确定某种药理作用的有效部位或有效成分，对于有效部位采用现代色谱分析技术确定其化学成分，并分析其质与量的变化与药效的关系，在一定程度上阐明复方组方的配伍规律及疗效机制。采用这种研究思路已经进行了补阳还五汤、银翘散、四逆散、清脑宣窍方、参芍心欣方、苦参汤、黄连解毒汤、葛根芩连汤等的有效部位研究。如梁燕等[16]等通过研究补阳还五汤及其该方中的生物碱、苷两类有效部位对小鼠角叉菜胶所致动脉血栓形成的影响，证实补阳还五汤及其主要有效部位生物碱和苷可抑制该模型血栓形成，提示该方中生物碱和苷可能为其抗血栓的主要药效物质基础，其作用可能与抑制血小板活化和凝血亢进有关。
2.3中药复方含药血清药效成分的研究
中药复方多数是通过口服起效的。由于发挥药效的直接化学成分与口服前复方化学成分相比可能有很大变化，这样在进行体外药效学实验时，采用中药粗制剂直接加入离体反应体系中，就会存在方法学上的问题，使实验得出的结论不可靠。彭力宏等[17]采用神经元缺氧凋亡模型，加入补阳还五汤药物血清，应用碘化丙啶(propidiumiodide，pi)染色法经流式细胞仪检测神经元凋亡率，分光光度法检测丙二醛(mDa)、一氧化氮（no）含量，免疫组化法检测bcl一2表达。显示补阳还五汤显著抑制缺氧导致的神经元凋亡，并减少神经元缺氧后no、氧自由基(oxygenfreeradicals，oFR)的生成，上调bcl-2基因的表达。由此可见补阳还五汤对神经元缺氧凋亡有抑制作用，其机制可能与其减少神经元缺氧过程no、oFR生成，及上调bcl-2基因表达有关。
2.4中药复方代谢组学研究
中药的体内代谢组学研究是指以中医的整体观念和辨证论治思维为指导，结合整体性思路的代谢组学方法，把中药作为一个有机的整体，对中药成分在体内的代谢变化情况进行动态跟踪检测、定量和分类，明确中药进入人体后转变成什么成分发挥作用，如何转变的，追寻中药提取物的原型“关联”成分(群)，揭示中药成分结构一代谢一活性的相关性。中药治疗疾病就是多成分系统调控生命体的代谢网络，使代谢网络中的缺陷部分正常化，同时又不得干扰其它维持健康所必须代谢途径的调控[18]。中药作用机制的研究就是要阐明中药在这种调控作用中所起的作用和如何起作用。代谢组学通过认识体液“代谢指纹图谱”变化的原因，阐明中药作用的靶点或受体。王喜均等[19]基于代谢组学的系统化理论，以及茵陈蒿汤干预后的肝损伤大鼠代谢组的回调趋势。同时，借助mS解析理论和主成分分析软件，明晰表征大鼠肝损伤的5个内源性特征生物标记物，并结合系统生物学的理论还原肝损伤的机理与实质，以及茵陈蒿汤的肝损伤防治机理，从药物代谢组学角度对经典方剂防治肝损伤给出全新解释。
2.5中药复方物质基础新技术新方法的应用
2.5.1利用细胞生物色谱分析方剂血清中的活性成份色谱、光谱技术在中药成份分析中的应用，极大地推动了中药及其复方成份的研究。然而，效应与成分关系的研究难度在于难以得到一定量的可供效应分析的化合物，微量及纳克级的化合物效应分析技术不容易建立。细胞膜固相色谱技术就是在这一背景诞生的。细胞膜固相色谱技术的基本原理是：药物效应的产生是由于药物分子与细胞上的生物大分子(如受体)结合，激活了生物信号放大系统。因此能与细胞靶点结合的化学成分才有可能产生生物效应。
2.5.2利用分子中药组学技术研究中药复方的物质基础及其作用机制[20]该理论认为中药复方是通过化学成分组合影响到信号分子组合，使紊乱的信号分子网络恢复平衡，从而达到治疗中医的证和相关疾病的作用和效果。以往对中医证候本质研究多局限在单个分子水平，采取的研究路线是从证候直接到信号分子，中间缺少分子网络和作用通路相连接，对复方研究的路线是中药复方作用部位有效成分，往往忽略成分之间的相互作用。
2.5.3建立模式生物细胞中基因表达模型，从多靶点、多途径地研究中药复方的成分①建立模式生物细胞中基因表达模型。采用模式生物细胞进行实验，条件容易控制。目前已有多种模式生物的基因组计划已经完成，如酵母菌是真核生物而且基因组已全部测序，细胞繁殖快，易于培养，与哺乳动物细胞有许多共同的生化机制，存在许多与人类疾病相关的基因。②构建致病基因腺病毒表达载体，转染靶细胞、器官，建立体内外疾病模型利用这些疾病模型可研究中药成分的药理效应。因而，可利用这些模式细胞来研究中药成分的作用。③充分利用生物信息学及计算机辅助技术预测中药方剂的药效物质基础[21]。
3中药复方物质基础研究的思考
3.1当前存在的问题
数十年来，人们对中药复方的化学成分和药理活性进行了大量研究，取得了一定的成绩，但是中药复方物质基础的研究仍存在如下问题：①中药复方物质基础的研究重视不够：认为中药复方是在中医药理论的指导下，按君臣佐使、七情和合等配伍原则组成的，已被证实临床有效，没必要非得“小白鼠点头”才算数。②中药复方物质基础研究信心不足：认为复方的组成少则数味，多则几十味，化学成分更是几十到数百；既有无机物、小分子有机物又有生物大分子物质，而且这么多的物质在炮制、制剂的过程中又可能发生新的变化，产生新的物质，如此复杂，无从下手，所谓“丸丹膏散、神仙难辨”。③中药复方物质基础的研究方法不当：只是简单地引入现代药物化学和药理学等理论和手段，以西医的药理作用作为评价指标，逐步提取、分离、追踪复方的化学成分，力图以某些或某种“有效成分”来说明一切，基本走上了“中药西化”的道路。
3.2中药复方物质基础研究的几点建议
3.2.1加强中药复方标准化研究①提高中药质量的可控性、稳定性，并使其应用更方便，这就涉及药材原料的质量、加工和供应，剂型和制剂工艺的先进、合理，内在质量检测监控的完善、严密。②阐明其药效的物质基础和作用机理。无论是中药复方还是单味中药，临床有疗效，药理有活性，必有其物质基础，应当要提高中药药理基础研究水平，采用新的靶点，从整体、器官、细胞-亚细胞、酶-基因水平阐明中药药效的物质基础，从本质上说明中药的安全、有效及其作用机制。
3.2.2加强中药复方药效相关性的研究与突破①加强中药复方有效组分配伍与药效相关性研究。采用现代分离提取手段，从全方中分离出若干化学部位（如皂苷类、黄酮类、生物碱等，每个化学部位为性质相近的化合物群）或化学成分[13]，然后根据复方的药理作用谱，对分离出的化学部位或化学成分进行适当配伍后，选择病症结合动物模型，在整体、离体、组织器官、细胞分子等不同水平，或在正常、病理、特定环境等不同机体状态下，观察并比较复方化学部位、化学成分配伍的药理效应，比较药材配伍和有效组分配伍作用的异同。以期在不同层次上探讨中药复方配伍与药效的相关性，从而可望研制出高效低毒、成分基本清楚、作用靶点明确的新型中药复方制剂。②加强复方和有效成分（群）配伍的量效关系的研究。在复方的运用中，不仅要考虑单味药物的剂量，更要注意药物用量之间的比例。剂量直接影响药物作用发挥的方向，从而影响方剂的功效。许多方剂是通过剂量变化相互制约、相互监制，起到佐制作用的。如小承气汤与厚朴三物汤，两方均以大黄、厚朴、枳实三药组成，但用量不同，两者的功效也不一样。因此，在方剂及其药效物质基础配伍研究方面，通过剂量及其配伍的研究，可望研制出高效低毒的中药复方制剂。
3.2.3加强对中药二次药效的研究①中药胃肠动力学研究：中药胃肠动力学是对中药制剂中活性成分在胃肠道内的化学成分变化和生物利用度的研究。口服制剂进入胃肠道后，受到胃肠道生理环境以及肠道菌群或酶的作用，化学成分发生变化而影响制剂生物利用度、疗效和安全性，所以中药胃肠药动学的中心问题是有效成分在胃肠内的动态变化及与药效的关系。②中药血清化学研究：复方中药的化学成分难计其数，但从另一个角度考虑就会发现，并不是每一种化学成分都被吸收进入血液。除外用药、胃肠道用药等特殊情况外，只有被吸收进入血液的化学成分才有可能发挥药效作用。因此，加强中药血清化学的研究非常必要。中药血清化学就是将口服给药一定时间后动物的血清分离出来，再将血清中的化学成分进一步提取分离鉴定，并进行药效筛选。这样就会在一定程度上使复杂的问题简单化，增加复方中药药效物质基础研究的命中率。
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分子生物学研究方法篇8
[论文摘要]：对细菌分类学研究的目的简单论述。对分类学研究中的多相分类方法包括经典分类，化学分类，分子分类，数值分类进行了详细的介绍，从而为临床和科研中细菌鉴定方法的选择应用提供参考依据。同时对分类学发展的研究趋势进行了简单的总结。
1.细菌分类学研究的目的
原核微生物系统分类是科学地研究微生物多样性及它们之间相互关系的基础学科[1]。细菌是原核微生物的重要成员，当前主要从两个方面进行细菌分类学的研究，一是为了实用的需要，建立各种细菌的信息库，从而更有效地开发利用细菌资源及有效地控制有害细菌。许多种细菌是微生物药物活性物质的重要来源。包括假单胞菌属(pesudomonas)、微球菌属(microcoeeus)、芽孢杆菌属(bacillus)、肠杆菌属(eneturbacetrium)和别单胞菌属(atleromonas)等。早在1966年，burkholder从含溴假单胞菌分离到抗生素硝吡咯菌素(pyornlirtin)[2]。二是建立反映细菌进化关系的自然分类系统，以揭示各种细菌的本质特征和相互关系，丰富生物多样性研究的内容。
2.细菌分类学研究方法
多相分类法是目前广泛使用的细菌分类学方法。在方法学上主要包括以下几种。
2.1经典分类
经典分类主要指依据形态特征和生理生化特征等表观分类学指征进行分类学研究，是多相分类研究的基础。
2.2化学分类
化学分类是根据生物细胞中某些特定化学物质的特征对生物个体进行分类的方法，是细菌属划分的主要特征之一。目前常使用的化学指征包括以下几种。
2.2.1磷酸类脂分析
磷酸类脂与蛋白质、糖等共同构成细胞膜，对于物种运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。具有分类学意义的磷酸类脂是：pe、pc、pme、pg和glunus等五种。
2.2.2脂肪酸组分分析
脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团在细菌中具有分类学意义。脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析结果可为种和亚种分类提供有用的基本资料。
2.2.3全细胞蛋白电泳分析
高度标准化的sds-page是对大量密切相关菌株进行比较归类的有效方法，研究证明全细胞蛋白组分和dna-dna杂交有很好相关性[3]。此法用于种或种以下分类单位的研究。
2.3分子分类
分子分类是在分子水平上对生物个体的dna、rna和蛋白质进行研究分类的方法。目前经常使用的分子指征包括以下几种。
2.3.1g+cmol％测定
g+cmol％主要用于验证已建立的分类关系是否正确。通常认为：种内菌株间g+cmol％相差不超过4％，属内菌株间相差不超过10％。
2.3.2dna同源性分析
分析dna同源性的有效手段是dna-dna杂交，适用于种水平的分类学。1987年，国际系统细菌学委员会规定，dna同源性≥70％为细菌种的界限。dna-dna杂交常用的方法有液相复性速率法和固相膜杂交等。
2.3.3dna为基础的分型方法
以dna为基础的分型方法指可将种分为不同型的技术。其中早期的rflp，缺点是图谱复杂，难于比较。选用专一识别6－8个碱基序列的限制性内切酶，dna片段数量就大大减少的lfrfa被认为是目前分辨率最高的dna分型法之一。但这样切出的dna片段太大，只能用脉冲场凝胶电泳分开。rapda、ardra、aflp等技术多用于种水平的研究。
rep-pcr所采用的分类信息来自于全基因组。该方法分辨率高、重现性好，在一定程度上与16srrna基因序列比较结果相一致，可作为一种快速鉴定的方法[4]。
2.3.4rrna同源性分析
现在一般认为，rrna是研究系统进化关系的最好材料。它广泛存在，功能稳定，由高度保守区和可变区组成。最初人们通过rrna-dna杂交和寡核苷酸编目法间接研究rrna的同源性。dna-rrna杂交反映的是属与属以上水平的信息[5]。
研究rrna同源性最直接可靠的方法是rrna核苷酸序列分析。目前，以16srrna序列分析的应用最为广泛。
2.3.5特异引物pcr
16srrna特异引物的设计是建立在大量序列分析基础之上的。若能设计出一系列特异引物，如属特异引物，则菌种筛选过程将大为简化。种特异的引物主要用于鉴定，结合属特异引物联合应用则可能发现新种。
3.细菌分类学发展的研究趋势
今后细菌分类学的发展将集中于以下几个方面：
(1)分析方法的标准化
有研究表明，细菌的脂肪酸、磷脂与醌类组成及含量随着培养条件的变化而不同[71]。所以化学分类必须建立标准化的方法，这样定量才有意义，更准确，更具可比性。
(2)多相分类方法的广泛应用及分子分类法的发展
由于各种分子生物学技术方法在分类学中的应用，细菌分类学家的研究重点已不仅是对某个分类单元的分类鉴定，而是通过分子分类的方法把分类与进化紧密的结合起来。在未来几年内16srdna/rrna作为重要的系统发育分子仍将发挥主导作用，但是其它保守分子将更多的用于系统发育研究，如rna聚合酶p,hsp60基因，延伸因子tu,23srdna/rrna,rdna转录间隔区等。
(3)“在线分类”的发展
现代细菌分类研究越来越依赖于internet，我们不仅需要大量的分子生物学和系统发育分析软件，更离不开网上丰富的信息资源。因此，oren和stackebrandt于2002年提出了原核生物“在线分类”(onlinetaxonomy)的概念[6]。
(4)分类学研究与细菌资源研究结合
很多科研单位己注意到将系统分类与细菌资源的开发研究相结合，例如日本的北理研究所、理化研研究所、明治制药等。
参考文献
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分子生物学研究方法篇9
关键词：分子生物学;课程;教学改革
中图分类号：G642.0文献标志码：a文章编号：1674-9324（2015）43-0089-02
分子生物学是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科[1]。目前大部分高校的生命科学专业都开设了分子生物学课程，是本科生必修的专业课程。同时，这门课对于任何一位从事生命科学领域研究的工作者都非常重要，尽管他们的研究对象不同，可能是微生物、动物、植物或者人，但都要用到分子生物学的理论和技术去解决问题。因此，为了培养出高水平的生命科学类专业人才，应当将分子生物学课程的建设与教学改革作为生物技术类学科建设的重要内容。笔者在分子生物学的教学实践中，结合学科发展趋势和专业特点，根据广西大学生命科学技术学院的实际情况，对分子生物学课程的教学改革进行了初步的探索。
一、教材选择与课程体系优化
为了适应当前社会对复合型人才的需要，高校大学生的选修课程不断增加，导致必修课教学时数减少。因此，教学中面临的问题就是利用较少的学时保证生物技术类专业核心课程分子生物学的教学质量。同时，分子生物学是一门理论和技术并重的学科，是一门内容飞速发展的学科。因此，选取合适的教材并对其进行内容优化是至关重要的。目前关于分子生物学的教材很多，有中文的有英文的，根据多年的教学实践，笔者选取的主要教材是北京大学朱玉贤主编的《现代分子生物学》，该教材内容设置合理，兼顾了分子生物学的基础理论和前沿进展，并着重介绍了分子生物学研究方法。而在教学课时的限制下，需要对具体的教学内容进行调整优化，如涉及中心法则的复制、转录及翻译等过程，重点讲解这些现象揭示的过程以及原核生物和真核生物的区别，对于一些学生已经掌握的概念则简单介绍。同时，为了使学生能够轻松地阅读和理解外文文献，还推荐他们在业余时间阅读由lewin主编的《GenesX》，该书被誉为分子遗传学的圣经，有助于学生提高专业英语的水平，为将来查看外文文献追踪前沿技术打下坚实的基础。另外，为了加深学生对重要知识点的理解，还推荐学生阅读杨荣武主编的《分子生物学学习指南与习题解析》，有助于他们把握分子生物学课程的重点内容。
二、突出教学重点，发挥学生主动性
分子生物学研究的内容日新月异，新的技术层出不穷，原有的理论也不断更新，尤其在研究方法、基因表达调控、基因与人类健康及基因组学等方面。为了让学生能深刻理解这些新知识、掌握新方法，就有必要在教学过程中也把这些作为重点学习内容。比如蛋白质的翻译后修饰是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，但是以前书上着重介绍磷酸化修饰，而较少提到乙酰化和泛素化这两种修饰方式。而随着近十年人们发现越来越多的细胞内关键蛋白质受到这两种修饰方式的调节，也使得我们对真核基因表达调控有了更深入的理解。为了让学生能对真核基因表达调控有更深入的认识，就需要教师在讲课时一定要结合相关文献，将重点内容发展的过程呈现给学生，使他们能用发展的眼光去看待科学问题。另外，为了发挥学生在学习中的主体作用，教师应该“授人以鱼不如授人以渔”，改变传统的“教师讲、学生听”的模式，采取灵活多变的教学模式调动学生学习的自主性[2]。例如，在学习分子生物学研究方法时，教师可以布置几道思考题，如研究蛋白质相互作用的方法、研究Dna和蛋白质相互作用的方法、检测基因表达水平的方法等，让学生自由组合成几个小组，每个小组选一道题目进行课下准备，然后在课堂上由学生自己讲解，其他同学提问，教师负责对内容把关及补充。这种变“学生听”为“学生讲”的模式可以激发学生学习的自主性，同时也让他们通过自己查资料及讲解的过程对相关知识有比较深入的理解。
三、改革分子生物学实验教学，提升学生实践能力
分子生物学是一门理论与实验并重的学科，学生只有通过亲手实践，才能对课堂学习的知识进行理解巩固[3-4]。同时，学生在实验过程中可以锻炼他们的动手能力、分析能力和统筹能力，积攒成功的经验和失败的教训，这对于学生将来的学习工作具有重要意义。分子生物学实验课可以增加一些比较前沿的实验内容，让学生接触最新、应用范围最广的实验方法，如酵母双杂交实验、基因定点突变实验、基因敲除实验等。同时，还可以将一些难度大、耗时长的实验作为选修实验，如Southernblot、westernblot等，让部分有兴趣的学生跟随研究生一起学习，边学习边动手，从而提高他们的实践能力。另外，为了提高学生分析问题、解决问题的能力，还应该增设一些综合性较强的实验，如教师列出一个小的课题，由学生自己查资料制定实验方案，教师审核后，学生自己安排时间完成实验，最后按照标准的格式撰写论文，包括研究背景、研究目的、研究方法、实验结果与讨论，这样的教学模式既锻炼了学生的实践能力，又使他们主动掌握了科研论文的查阅及写作方法。
四、提高教师科研能力，改善教学质量
优秀的教师队伍，是高水平的科学研究和高质量教学的根本保证。正如古语所言“要给学生一瓢水，教师就得有一桶水”，要想培养出一流的学生，教师自身要努力成为一流的教师。因为分子生物学课程理论性较强，对于很多比较抽象的知识点，教师必须结合自己的实践经验进行讲解，将科研成果及实践体会引入课堂，才能引起学生的共鸣，使学生更容易理解接受。这些都要求教师根据个人不同情况，进行不断地学习、补充、提高，不断深入地提高科研能力及知识水平，这是上好课的必要条件。比如在讲授分子生物学研究方法这一章时，为了让学生掌握几种研究蛋白质相互作用的方法，笔者结合自己的实践经验，将这些方法分为体外研究、体内研究两个方面，并对每种方法操作所需要的仪器、试剂、优缺点进行了详细的解析，使学生们在比较中掌握每种方法的原理及操作要点，收到较好的教学效果。同时，只有教师深入分子生物学科研的第一线，才能及时跟上学科的发展脚步，把握学科发展趋势，在自己擅长的领域取得科研成果。而教师成果的取得也会影响学生对本专业的学习态度，为学生树立一个学习的榜样，激发学生对课程的学习热情，带领学生在实践中不断学习提高，从而有效地改善教学质量。
五、改革课程考核方式，引导学生全面发展
课程考核是检验教师教学、学生学习效果的重要方式。传统的考核方式是通过试卷检查学生对知识的掌握程度，而学生往往可以通过突击性的考前复习取得高分，这样的结果既不能反映教师的教学效果，也不能反映学生对知识的综合运用能力。根据分子生物学课程的特点，笔者在教学中采取灵活多样的考核方式。一是随机的课堂考核。课堂考核主要是以课堂讨论为基础的考核方式，传统的“满堂灌”授课方式已远远不能满足素质教育的要求，而课堂讨论恰恰突出了学生的主体地位，是教学改革的必然产物，也是发挥学生学习主动性和积极性的有效途径之一。二是实践考核。实践是检验真理的唯一标准。同样，能否将所学知识应用于科学研究实践中也是检验学生能否真正掌握分子生物学的途径之一。由于生物技术专业立足于科学研究和面向生物科技企业，培养具有实际操作技能、适应学科发展和建设高科技生物企业需要的高级技术人才也是对生物技术专业教育的要求。因此，实践考核是课程考核的重要部分。让学生进入实验室、走出校门、参与企业的实际生产锻炼，把书本的知识转化成实际的操作，真正学会操作技能，提高学生的实践能力，同时在实践中培养他们发现问题和解决问题的能力。
六、结语
分子生物学的教学改革有利于提高教学质量，培养合格的、有创新能力的生物技术人才。选择适合的教材并进行课程体系优化，突出教学重点，发挥学生的主动性，改革实验教学，提高教师科研能力，改革课程考核方式，必将有利于课程教学质量的改善以及学生科研素质的全面提高。
参考文献：
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分子生物学研究方法篇10
关键词:豆科牧草;抗旱性;鉴定方法;鉴定指标
中图分类号:S54文献标识码:a
文章编号:1674-0432(2010)-05-0047-2
近些年来,由于全世界人口的大幅增长和社会经济的快速发展,全球Co2、CH4等气体的排放量日益增加,引起全球气候发生显著的变化,全球气候变暖导致全球气候干旱的趋势进一步延续。据统计,世界范围内由于干旱缺水造成的农业和社会损失相当于其它各种自然灾害所造成损失的总和。而我国又是水资源相对比较贫乏的国家,人均水资源的占有率甚至还达不到世界平均水平的1/4,居于世界第109位。严重的水分亏缺已经成为制约我国各地区农牧业和社会经济可持续发展的重大因素。因此,通过认识作物对干旱的反应,研究作物抵抗干旱的生理机制,培育优良的抗旱品种是我国农业生产的当务之急。
豆科牧草是我国东北农牧交错带草地畜牧业发展的粗蛋白重要来源之一,不仅能提供较高的蛋白质营养,还可以通过根瘤菌固定大气中的氮,将其转化为草地生态系统中的氮素营养,同时又可以培肥地力、改良土壤。在密集型畜牧业区域,即使动物饲料主要来源于农作物,但在维持牲畜健康方面,豆科牧草的作用仍无法取代。现今国内外对豆科牧草的研究十分重视,随着人们对干旱问题的进一步重视,国内外专家学者就豆科牧草抗旱性做了大量研究,并且取得了一系列重要成果。本文结合国内外豆科牧草抗旱性相关研究,对豆科牧草抗旱性鉴定方法以及鉴定指标研究进展进行阐述。
一、豆科牧草抗旱性鉴定方法
目前豆科牧草抗旱性鉴定的研究方法有很多,但大体可以分为四种,即田间直接鉴定法、人工控制干旱胁迫鉴定法、实验室高渗溶液鉴定法和分子生物学方法。我们在选择抗旱性鉴定方法时,应根据实际条件选择可靠实用而又简单易行的方法。
(一)田间直接鉴定法
将需鉴定品种直接种植于田间,利用自然干旱条件造成水分胁迫,从而使其使生长发育受到影响,使用人工灌溉作对照,主要根据产量指标(种子产量、干草产量)和形态学指标(植株生长速度、萎蔫状况、死亡率、存活率、根系生长状况等)评价抗旱性。梁成第等应用此方法鉴定了902份大豆品种的抗旱性。
田间直接鉴定方法优点在于简单易行,所获结果在当地条件下比较可靠,并且在进行大规模的鉴定时十分有效。但是其缺点是受环境条件影响大、所需时间长、工作量大、速度慢并且每年结果可比性差难以重复,因此需要在多点和多年份进行重复鉴定以提高试验的准确性和可靠性。
(二)人工控制干旱胁迫鉴定法
将需鉴定品种种植于人工控制水分的干旱棚、花盆、生长箱、抗旱池或人工气候箱内,研究水分胁迫对其产量、生理过程和生长发育方面的影响,或者以田间土壤自然干旱条件为对照,比较其各类指标的变化对作物进行抗旱性评价。主要方法有反复干旱法和连续干旱法。
人工控制干旱胁迫法优点是便于控制土壤的水分含量,同时可以控制空气湿度来施加干旱胁迫。因此人工控制干旱胁迫法较田间直接鉴定法更为精确,鉴定结果更便于对比,也比较可靠。但是人工控制干旱胁迫法资源消耗量大,需要一定的设备所以无法进行大规模的鉴定。同时,因为试验环境与自然环境有一定差异,所以有可能带来试验误差。
(三)实验室高渗溶液鉴定法
实验室高渗溶液鉴定法指的是在实验室内通过使用如聚乙二醇(peG)、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等高渗溶液造成植物生理干旱达到模拟干旱效果。通过观察其对种子萌发和幼苗生长发育的影响,鉴定品种苗期的抗旱性。郝建辉曾使用实验室高渗溶液鉴定法对扁蓿豆进行了苗期抗旱性鉴定。
实验室高渗溶液鉴定法优点是周期短,简单易行,只要种子质量有保证,可以做为大批量的筛选方法。但是此方法仍存在争议,有部分研究者认为,高渗溶液中的种子发芽率不能代表苗期的抗旱性。
(四)分子生物学方法
近年来部分专家学者提出,直接找出标记基因,用这种基因的表达形式确定抗旱指标。程星以百脉根为实验材料,用根癌农杆菌介导的方法成功地将aVp1基因转入百脉根,对得到的8株抗性植株进行pCR检测,并对转基因植株的耐盐性和抗旱性进行检测。该研究表明,过量表达aVp1可明显增强转基因植株的耐盐性和抗旱性。分子生物学方法目前尚处于研究阶段,并且成本较高。但随着分子生物学的发展,不久的将来应用分子标记技术建立植物抗旱性综合评价体系必将取得突破。
二、豆科牧草抗旱性评价指标
对豆科牧草抗旱性评价指标的研究,前人已经做了大量工作,研究发现了多种抗旱相关指标,但真正简便、实用,而又准确可靠的指标却屈指可数。本文结合周正贵对白三叶苗期抗旱性的研究以及郭正刚等对紫花苜蓿干旱适应性的研究等,将它们归为形态指标、生长发育指标、生理生化指标、产量指标和分子生物学指标五类。
(一)形态指标
抗旱形态指标主要包括株高、根系状况和叶子特征,其中度量根系状况的指标有根重、根径、根长、根数、根伸展速率和根冠比等。而叶子的特征则分为,叶片厚度、叶片大小、蜡被、绒毛、气孔频率、栅栏组织/海绵组织比值等。抗旱形态指标是广大育种工作者通过长期的育种实践工作所积累总结出来的。该指标测定程序简单,测定结果直观可靠。
(二)生长发育指标
生长发育指标包括生长速率、幼苗干重、干物质积累速率和叶片扩展速率等,这些指标受干旱胁迫的影响明显,使用这些指标来评价品种的抗旱性较为直观、可靠。植物在不同的生长发育阶段,对干旱的适应能力有明显的差异,同时干旱胁迫对植物的生长发育也必然产生影响,因此植物的生长发育指标在植物抗旱性的研究中具有相当高的使用频率。
(三)生理生化指标
在干旱胁迫条件下,任何植物的生理代谢活动和生长发育进程都会受到影响。为了抵抗干旱环境植物在形态结构上和内部生理代谢活动中都会产生适应性调整。生理生化指标针对的就是植物内部生理代谢活动在干旱胁迫下的适应性调整。其中光合作用、蒸腾作用、水分饱和亏缺(wSD)、叶水势、相对含水量(RwC)、相对组织含水量、自由水与束缚水、叶片离体失水速度、质膜渗透伤害率、脱落酸(aBa)含量、游离脯氨酸含量和保护酶系等指标国内外专家学者做了大量的研究。
(四)产量性状指标
产量表现是传统抗旱育种用来判定植物品种或品系抗旱性的经典指标。Chionoy(1962)提出了抗旱系数(旱地产量/水地产量),曾被许多研究者作为评价植物抗旱性的产量指标,但是该指标有一定局限性,难以为育种工作者提供选择高产抗旱品种的依据。兰巨生于1990年提出了“抗旱指数”Di概念,对抗旱系数做出了改进。现在普遍认为Di能更有效的估计植物对干旱的适应性。其表达式如下:
式中Di表示抗旱指数,mD表示某品种在旱地实验中的平均产量,mw表示某品种在水地试验中的品均产量,mΣmD表示所有供试品种旱地品均产量。
(五)分子生物学指标
近些年来,随着分子生物学技术的发展,抗旱研究己进入分子水平。有学者已经应用限制性片段长度多态性(RFLp)技术对抗旱基因及其相关基因,建立起RFLp遗传连锁图。国内豆科牧草抗旱性分子生物学方面的相关研究也取得了一定成果,米福贵等对冰草、苜蓿、高羊茅三种牧草进行了抗旱、耐盐基因工程育种。
四、结语
近些年来,对豆科牧草抗旱性方面的研究在许多方面取得了突破性进展,为干旱半干旱地区的农林业生产做出了重要的贡献。但这些研究还具有一定的局限性,如某些生理或生化指标,只在某一时间范围内起着有限的作用,用这些具有时间限制的指标来进行耐旱性评价是难以反映其真实情况的,甚至忽略某些最关键的问题。各研究中对各种生理变化之间的内在联系研究的还不够深入,还不能确定起主导作用的变化过程是什么,哪种生理反应最先开始,并由这些反应导致了其他的生理变化。综上所述,建议今后应从以下几方面入手:
第一建立综合的抗旱性评价体系,加强抗旱性指标的筛选,为豆科牧草及其他作物的抗旱性研究提供可靠的理论依据。
第二从分子水平结合最新的分子生物学技术对豆科牧草抗旱性进一步深化研究,揭示其抗旱分子机制,阐明其物质基础及其生理功能,为培育抗旱性强的豆科牧草优良品种提供重要参考依据。
第三从生物工程方面入手,加强豆科牧草相关抗旱基因的研究,通过基因重组,应用常规育种与遗传工程相结合的方法培育优良的豆科牧草抗旱品种。
第四大力发展抗旱性强的豆科牧草尤其是野生抗旱豆科牧草的引种驯化力度,为地方性的豆科牧草抗旱性研究和利用提供重要的种质资源。
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