细胞生物学研究方向篇1
细胞发生物理力学性能上的改变最终使得细胞分裂失控，结果便是这些分裂失控的细胞出现较低的死亡率，导致恶性肿瘤的增长。该研究发现是目前唯一一种从物理学的角度分析肿瘤的发病原因。该论文已经发表在最近出版的《物理评论快报》上，该期刊由美国物理协会创办。
博士后研究生保劳格帕尔克对该研究评论为：到目前为止，关于癌症的研究都集中在生化角度，为了寻找解决与生化致癌相关的各种相互依存的诱发因素，我们将焦点集中在较不“显眼”的细胞机械因素方向。这是一种新的针对癌症诱发因素研究方法。然而，研究人员在区别癌变细胞与正常细胞过程中发生了怪异的相似性，比如在细胞的机械强度和粘附性方面，癌变细胞之间表现出与正常细胞迥然不同的特点。
这些特点也是研究人员区别癌变细胞与正常细胞的方法，其同样也类似于以前观察癌变细胞时的分类法。根据研究人员介绍：癌变得细胞较健康的细胞显得更加柔软，这就意味着当这些柔软的癌变细胞被较硬的正常细胞所包围时，前者就会变得更紧实，不易扩散。但是，当相邻的癌变细胞数量增加时，来自正常细胞的较硬表面“对抗力”就出现了降低，这时候癌变细胞“趁机”松弛下来，扩大自己的表面积，以便覆盖更大的区域。拉伸的细胞可以提高自身的增值能力，并降低了细胞死亡的概率。
该研究小组的研究人员通过精确的计算模型复制了在一个组织内细胞的生命周期，便于观察细胞机械性能的改变如何对细胞的行为产生影响。在实验开始前，研究人员确定在这个健康的组织内有相同机械性能以及粘附性的细胞，然后在组织中心将一些细胞软化，结果显示只要软化的细胞低于临界值，这个组织仍然会保持健康、稳定。
如果超过了这个临界值，机械性能出现变化的柔软细胞就会出现倍数式增加，远远大于正常健康的细胞。除了这一点外，肿瘤的增长是依靠自身强大的繁殖能力替换到周围健康的细胞，临床观察也显示这也是恶性肿瘤的一个特征。研究人员还分析了如何使一个细胞增加粘附性，或者保持较硬的机械性能，以及影响其他细胞的转移性能和繁殖能力。他们观察到软化细胞之间的结合能力出现了改变，该变化是控制着更多肿瘤细胞形成的一个关键因素。
细胞生物学研究方向篇2
关键词：干细胞生物学中药神经细胞
我国现在是越来越重视中医药了，而且随着中医药研究的深入和发展，传统中医药的细胞生物学以及免疫学研究已经得到了很丰富的经验以及研究资料。基因组学研究带给了中医药研究新的切入点，而且随着中草药基因组学的研究更加深化，传统中医药将会走向世界。
一、干细胞生物学的发展和研究进程
干细胞是一种具有多向分化潜能、高度增殖以及自我复制的细胞,而且在一定条件下能够分化成具有多种功能的细胞。动物的发育离不开胚胎干细胞，这种细胞是一种高度还没有分化的细胞，有发育的全能性,可以把成体动物的全部器官和组织分化出来。胚胎干细胞通常是哺乳动物的基因表达调控、细胞分化以及早期胚胎发生等发育生物学研究非常理想的模型，其也广泛应用于临床医学的应用研究以及基础研究。在成年动物的器官和组织当中，都存在组织成体干细胞，这种细胞具有再生和修复和能力，在成体干细胞以及组织创伤修复中存在着非常重要的作用，在某些特定的情况下能够通过一定的程序进行分化，进而形成一些新的功能细胞，维持器官和组织衰退、生长的动态平衡。
（一）胚胎干细胞的发展
在上个世纪的七十年代其实胚胎干细胞研究就已经开始了，英国科学家martinevans爵士首次将小鼠中的胚胎干细胞分离了出来并进行了体外培养。在上个世纪的八十年代初，Kaufman和evans首次制定了小鼠eS细胞（胚胎干细胞）系。在1998年ShamblottmJ和thomasonJa
将人类的eS细胞系建立了起来。ShamblottmJ已经证明了培养条件不一样的胚胎干细胞所具有的的重要性质也不一样，eS细胞确实有很多分化能力，能够把中胚叶、内胚叶已经原始外胚叶细胞表面所具有的的特异性标志蛋白表达出来。
（二）组织成体干细胞当前的研究进展
成年动物的很多器官和组织当中，都含有组织成体干细胞，在某种特定的情况下，新产生的或者是成体干细胞能够按照一定的程序进行分化，从而形成新的功能细胞，使器官和组织的衰退、生长都能够维持动态的平衡。一般来说，成体干细胞位于某些特定的微环境中，在这种环境之中的间质细胞可以产生一系列的配体或者是生长因子，和干细胞进行相互作用，达到控制干细胞的分化以及更新的目的。而且成年动物身体当中的组织器官再生和修复是离不开成体干细胞的。现在由于科技发展的水平高了，干细胞的理论研究有了深入的发展，相关的科学家在所有的组织内全部都发现存在有干细胞，并且当前已经证实了在胎儿或者是成体当中的神经、骨髓、上皮、肝脏、肌肉以及皮肤等组织中就有干细胞的存在，而且在体外这些细胞都能够多向分化、高度有限的增殖，在某种特定的条件下胚层起源不同的干细胞还可以进行互相转化。
二、中药和神经干细胞
（一）神经干细胞的生物学特性
神经干细胞是在1992年被ReynoldsBa首次在成年鼠的海马和鼠纹状体中分离出来的，这种细胞是一种有多分化潜能、能不断增殖的细胞群，能够分化为少突胶质细胞、神经元以及星形胶质细胞，可以进行自我更新，能够通过对称分裂以及不对称分裂确保祖细胞以及干细胞的数量，提供给脑组织修复必须的神经细胞。通过进一步的研究我们可以证实哺乳动物处于胚胎期时，神经干细胞主要分布在大脑的中脑、皮层、室管膜下层、纹状体以及海马等区域，等到其成年之后大脑的中枢神经系统还存在神经干细胞，但是主要被局限在纹状体、海马齿状回等处。在大脑受到损坏时，这些神经干细胞就会向损伤部位移动，对其实施修复。
（二）中药所影响到的神经干细胞所进行的增殖分化
1、人参皂苷能够推动神经干细胞的增殖，大大的对学习记忆能力进行改善
大脑的海马结构齿状回有着非常多的神经细胞，能够增殖分化成很多种神经元，在这些神经元移动到了颗粒细胞层后，便会有突触传递功能，以及衰老、β-淀粉样蛋白、神经退行性疾病等对神经干细胞进行损坏的自我更新能力，其还能够对抗学习记忆能力减弱、新生神经元数量减少、海马逐渐萎缩等。
人参是一种五加科植物，在我国非常的普遍和常用，含有人参皂苷Rg1和Rb1。有实验证明，长期的使用人参皂苷Rg1能够帮助海马区大量的新生细胞存活下去，大大的提高存活率；对海马Ca1区神经元细胞起保护作用，防止其受到缺血性损害；其还能够增强动物的学习以及记忆的能力。
2、银杏内酯能够对神经干细胞分化产生影响
银杏是一种银杏科植物，它的叶子能够提取出萜烯内酯类和黄酮糖苷类，而银杏内酯化合物是一种萜类化合物由二萜内酯和倍半萜内酯构，是一种非常重要的活性成分，其中包含着白果内酯以及银杏内酯a、B、C、m、J。银杏内酯B当中的拮抗氧自由基还能够对抗神经元的损伤作用，增强神经元的钙离子所具有的缓冲能力，对脑内钙的平衡起到双向调节作用，提高细胞膜的稳定性，达到与损害神经元的多种因素对抗的作用。银杏内酯B能够推动神经干细胞分化成为神经元细胞；银杏内酯B的不同浓度能够提高星形胶质样细胞在进行分化时的成功率。
总结：根据神经干细胞生物学所具有的特点，使用中医药来对神经系统疾病进行治疗的原理和方法研究，是当前的中药神经药理学等方面研究的热点。而且很多的学者研究探讨了中药推动神经干细胞进行增殖分化的方法，说明了在中枢神经的功能重建以及结构修复中中医药的作用机制。所以寻找能够促进神经细胞向少突胶质细胞、神经元以及胶质细胞分化，并可以增强分化数量的中药，这有利于补充修复神经损伤，具有非常大的社会效益，并为未来的新药开发提供基础。
参考文献：
[1]鞠秀兰.中药皂苷对干细胞增殖分化的影响[J].时珍国医国药.2010(11)
细胞生物学研究方向篇3
近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着干细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。
【关键词】干细胞生物特性应用
近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着于细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。
1干细胞的概念
干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。按照干细胞的分化潜能，分化层次及其所具有的功能，大致可分为三种类型：胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。胚胎干细胞又称全能干细胞，是从哺乳动物包括人的早期胚胎分离培养出来的。其分化潜能大、增殖能力强，既是胚胎发育的基础，又是机体各种细胞最早的祖先，由它可形成完整的生物个体，如早期的卵裂球细胞、胚泡中的内细胞群中的细胞、早期生殖嵴的胚芽细胞等。从某种意义上说受精卵也可视为特殊的全能干细胞。胚胎干细胞在进一步的分化中，可形成各种组织干细胞，又称多能干细胞，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如多能造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等均属于此类。这些多能干细胞在一定条件下可分化成定向发育的、多系列的专能干细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的细胞．专能干细胞的分裂是不对称性的，即在其所形成的2个子代细胞中，1个仍保留原来干细胞的全部特征，以维持机体内干细胞在数量上和质量上的稳定；而另一子细胞却开始分化，发育，最终形成新的具有特定形态和功能的体细胞，以对正常相应组织细胞加以补充，维持细胞器官生长与衰亡之间的动态平衡。由于全能干细胞分化发育成体细胞的过程，是一个连续的过程，也是细胞数量上由少到多，功能上由幼稚到成熟的增殖、放大的过程。
2干细胞的生物学特性
干细胞具有多种生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。干细胞本身不是处于分化途径的终端，它可连续分裂几代，也可在较长时间保持静止状态；干细胞通过两种方式生长，一种是分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂，一个子细胞最终分化为功能细胞，另一个分裂成为干细胞保留下来；干细胞表现出很强的可塑性，其调控机制目前尚未清楚。
2.1胚胎干细胞(eSC)的生物学特性eSC细胞具有早期胚胎细胞相似的结构特征，有较高的核质比和正常的整倍体核型。胚胎细胞在发育的不同阶段，其细胞表面出现不同的抗原。未分化的人eSC细胞表面SSea3、SSea4、ti160、tRa181等呈阳性。而未分化的小鼠eS细胞表面仅SSea1抗原阳性Ⅱ［1］未分化的eSC细胞表达高水平的端粒酶活性和转录因子oct4，碱性磷酸酶染色呈阳性。胚胎干细胞的表面抗原是指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达，一旦分化，基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达，可成为鉴定胚胎干细胞的依据［2］。
2.2成体干细胞的生物学特性成体干细胞(aSC)是一类具有自我更新，高度增殖和多分化潜能的细胞群，有横向分化能力。目前国内外学者研究热点是其横向分化能力。其机制还不清楚，目前被大家接受的观点主要有以下几种：（1）异质干细胞的存在；（2）原始多能干细胞的持续存在。美国的学者JiangY等［3］提出成体骨髓中确实存在一类被称为多潜能的成体干细胞(mapC)，mapC表达oct4、Rex1，虽然较eS细胞表达低，但一般的成体干细胞不表达；（3）细胞融合，移植的1细胞与不同谱系的宿主细胞自发融合，导致遗传信息的转移，形成的杂合细胞遗传了两个亲代细胞的特征，如teradan等［4］研究证实骨髓基质细胞通过细胞融合表现出其他细胞的表型。aSC的鉴定识别主要通过三种途径［5］：分离培养和形态学观察；免疫表型鉴定；分化功能检测。分离培养和形态学观察是最直接简单的鉴别方法：如利用问充质干细胞(mSC)在培养瓶中可贴壁生长的特点，弃去未贴壁细胞，得到mSC集落，用显微镜观察细胞形态来辨别细胞。免疫表型鉴定是目前研究最多的，虽然其特异性比较高，但所需的实验条件较高，表面抗原试剂价格昂贵，且由于大多数成体细胞没有独特的免疫标记物，只能通过排除其他细胞来确定是否为目的细胞来识别鉴定：只有造血干细胞具有特异性的表面抗原CD34，而mSC就没有特异性表面抗原，它不表达CD34、CD14、CD45，只表达SH2、SH3、CD29、CD106、CD166。分化功能检测法主要是通过观察aSC诱导分化是否能生成预期的细胞类型来反证是否该种类型的干细胞：如mSC可诱导生成成骨细胞及软骨细胞，只要通过染色等方法证实诱导生成的细胞是成骨细胞或软骨细胞即可证明是mSC细胞，此法在目前的研究中用到比较多。
3干细胞的应用
3.1移植治疗移植治疗目前已经成为治疗疾病的一个重要手段，如器官移植、细胞移植等。干细胞移植是一个尤其重要而意义重大的手段。从20世纪80年代起，造血干细胞移植已经成为治疗癌症、造血系统疾病、自身免疫系统疾病的重要手段。之后，外周血干细胞移植并辅以化疗及细胞因子CG-CSF、Gm-CSF等，可使更多的干细胞进入外周血。1989首例脐血治疗Fanconi贫血成功后，许多国家纷纷建立了规模不等的脐血血库。因脐血富含造血干／祖细胞、其免疫细胞的抗原性较弱、C，iL祖细胞较少、移植相关GVHD的发生相对骨髓的外周血少而轻，采集容易、对供者无任何伤害。故被认为是极具潜力的新造血干细胞的来源［6，7］。神经干细胞的研究为神经系统疾病的治疗提供了广阔的应用前景。啮齿类中枢神经细胞系包括中枢神经干细胞已被用于许多鼠的疾病模型，如鼠遗传性神经退化症，包括脱髓鞘症、脑神经节苷脂沉积症和其它神经退化紊乱(包括多巴胺能神经．如肾上腺髓质．胚胎腹侧中脑和畸胎瘤组织的移植)治疗研究中［8］。神经干细胞的临床价值已在治疗帕金森病中得到证明。
3.2克隆动物及转基因动物的生产自绵羊“多莉”问世至今，体细胞克隆动物多有成功的报道。但体细胞克隆动物有着无法克服的弊端，即成功率低和容易早衰，“多莉”羊在它存活的第5个年头也终难逃一劫。而wakayama等用长期传代(30代以上)的小鼠es细胞克隆出31只小鼠，14只存活，可见存活率大大提高。因此KS细胞克隆动物具有光明前景。转基因动物是利用受精卵或eS细胞作为载体，通过注射目的基因，从而生产带有目的基因的动物。转基因eS细胞系将为大量同系转基因动物的生产奠定基础。应用干细胞进行动物克隆，可以有效地提高稀有动物的繁殖和高效畜产品的生产，以及高效生物活性物质的生产［9，10］。
3.3转基因干细胞基因治疗现有的基因治疗有2类：（1）转基因细胞治疗。（2）核酸治疗。前者常用的基因转移靶细胞多为淋巴细胞、成纤维细胞等。其缺陷为细胞存活时间有限，在治疗过程中需要反复输注，治疗繁琐。转基因干细胞技术解决了转基因细胞存活问题，成为转基因细胞治疗重要的方向。近年来，人类基因组测序为认识生命现象以及疾病发生的物质基础提供和建立了完整的信息库，Dna芯片技术就是在此信息库基础上对疾病诊断的方法学革命。与此同时，“分子治疗”技术也倍受关注。但是，由于蛋白质分子量巨大难以进入细胞，只能作用于细胞表面分子而发生作用，而且基因治疗有依赖病毒序列作为基因载体的弊病，因此限制了“分子治疗”的应用。(11)如何克服这些弊病，改进技术，是分子治疗领域的主要课题之一。干细胞生物工程正是改造“分子治疗”的。(1)干细胞具有自我扩增和分化功能，因此导入的“外源基因”可以有效地得以扩散；(2)干细胞可以在体外进行操作，对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导人体内，避免由于基因插入而导致的细胞失常；(3)干细胞是人体细胞，作为载体其毒性最小，而且作为生命的最小单元，是导入组织的最佳形式。
3.4eS细胞为发育生物学研究的理想体外模型KS细胞具有全能性和无限增殖能力，并能在体外培养。因此，可以作为微环境改变对细胞分化影响的理想研究材料。随着现代生物技术的发展，研究不同生长调节因子在eS细胞分化中的作用，已成为可能。尤其是基因芯片技术的完善，通过mRna差异显示，为eS细胞分化和不同分化阶段细胞的基因转录和表达的研究奠定基础，成为揭示发育和分化的分子机制的重要手段。
4存在的问题
干细胞研究虽然有很大的进展，但仍需解决许多难题：（1）干细胞的分离、纯化、增殖、鉴定的问题。这是所有问题的起点，如果没有扎实可靠的分离培养技术，也就没法进行后续实验研究。没有有效的增殖技术，就达不到细胞移植等治疗所需要的细胞数量。干细胞的纯化及鉴定目前虽然研究很多，但由于许多干细胞没有独特的表面抗原，所以其鉴定问题将是一大难题，需要各国科学家们进一步研究。（2）干细胞诱导分化的问题：每种组织细胞产生的诱导条件不同，这就需要研究者们后续摸索前进。（3）移植后免疫排斥反应：干细胞治疗虽然有广阔的应用前景，但利用eS细胞移植或异体干细胞移植治疗疾病过程中免疫相容性问题必须解决。一种解决eS细胞移植排斥反应，方法是从病人自身细胞的核移植分离heS细胞，这个概念称为“治疗性克隆”(12)；还可以通过暂时服用免疫抑制剂，然后逐渐停止服药；也可使用微胶囊法来阻止移植物与受体免疫系统间的相互作用等方法。（4）干细胞治疗中生物安全问题：干细胞在移植到体内后是否会分化成其他意料外的组织或引发其他疾病，这些都需要进一步的实验证实。其他的如伦理学和社会问题等等，需要学术界与政府机构共同协作，为干细胞的研究更上一层楼而努力。
5展望
基因组、后基因组计划和干细胞研究是20世纪与21世纪交替之际中生命科学中的两股强大的潮流，基因研究正在全力构筑起生命科学的基石，干细胞的基础研究及开发应用则将打开疾病治疗的突破口，它将成为21世纪生物产业的核心内容之一。美国《科学》杂志1999年和《时代》周刊和2000年相继将干细胞生物工程学评为世界十大科技成果之首，这项研究具有重要意义和诱人的应用前景，各国科学家都在关注和进行这一领域的研究，并吸引各种资本投入巨资投入这一领域，几乎所有的发达国家均成立了干细胞公司，开展干细胞生物学研究及提供干细胞应用服务。国内天津、北京、上海、广州等高校及科研单位也相继成立干细胞研究中心及干细胞技术公司。据最新报道，中国医学科学院天津血液研究所于2001年i1月4日通过了亚洲脐带血干细胞库的验收，该库从2001年4月18日接受第一例储存脐带血干至今，已收到近3000例脐血。南京市第一医院也将于近期用造血干细胞移植治疗严重的冠心病，使疤痕累累的心脏生长出新的心肌细胞。从目前发展的趋势看，干细胞的研究在不久的将来(3～5年)将会取得惊人的突破。如利用于细胞(特别是胚胎干细胞)培养产生人体各种组织器官，产生克隆器官，供人体移植使用，修补及替换损伤的组织器官，治疗各种疾病。但是在干细胞的研究中也存在着诸多困难有待于解决，目前急需解决的是各类干细胞分离纯化、鉴定、繁殖，它们之间定向分化的关系，临床实验应用中存在的问题等。应建立一系列可靠的技术方法，完善于细胞的建系。而且国际和国内应制定相应的法律法规，保证干细胞研究的合法化、规范化。
参考文献
［1］赵明，任彩萍．胚胎干细胞诱导分化的研究进展［J］．生命科学，2005，17(1)：19～24．
［2］胡娅莉，徐运，崔恒宓等．胚胎干细胞的研究进展［J］．医学研究生学报，2005，18(1)：77～80．
［3］JiangY，JahagirdarBn，ReinhardtRL，etal．plufipoteneyofmesenehyrealstemcellsderivedfromadultl'nKn'ow［J］．nature，2002，418(6893)：41～49．
［4］teradan，Hamazakit．okam，etal．Bonemarrowcellsadoptthephenotypeofothercellbyspontaneouscellfusion［J］．nature，2002，416(6880)：485～487.
［5］姜铧，张洹．间质干细胞来源、鉴定、可塑性和应用前景［J］．暨南大学学报(医学版)，2001，25(4)：468～473．
［6］黄秀榕．干细胞研究的最新进展［J］．福建中医学院．2002，12(1)：55～57.
［7］雷莉．干细胞的生物学特性及其进展［J］．医学综述．2002，8(2)：79～80.
［8］evansmJ，KanfmallmH．establishmentincultureofplurrpotentialcelsfrommollSeembryoslJJ．nature，1981，292：145～159．
［9］李树浓，徐令．人胚胎干细胞的分离和培养［J］．中山医科大学学报．1998，19(1)：77～80．
［10］曹虎．干细胞［J］．生物学通报．1996，31(5)：24～25．
细胞生物学研究方向篇4
[关键词]中药；骨髓间充质干细胞；增殖；凋亡；分化；研究进展
[收稿日期]2013-12-22
[基金项目]国家自然科学基金项目（30860357）
[通信作者]李玛琳，教授，e-mail：
[作者简介]方健康，硕士研究生，e-mail：
骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BmCSs）已有半个世纪的研究历史[1]，并日益受到研究人员的广泛关注。BmSCs在一定条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌样细胞、血管内皮细胞、神经元样细胞、肝细胞、脂肪细胞等多个方向分化。BmSCs所具备的这种多向分化潜能和自我更新能力，以及较容易获取、体外扩增快、低免疫排斥等优点，使其成为干细胞研究的热点。近年来，研究人员利用中药对体外培养的BmSCs进行干预，以探索这些中药对BmSCs增殖、凋亡及分化等生命活动的影响。这些探索将有助于阐明中医药的作用机制，将对我国中医药事业、重大疾病研究、细胞工程、组织工程等生命科学技术领域的发展产生积极的影响。
1中药促进BmSCs的增殖
细胞增殖是生物体最重要的生命活动之一，是生物生长、发育、繁殖、遗传的基础。近几年研究发现，多种中药对BmSCs的增殖具有一定的促进作用。曾意荣等[2]用由熟地黄、杜仲、补骨脂等组成的补肾活血复方颗粒对4周龄SD大鼠连续灌胃给药7d（高剂量组4.4g・kg-1，中剂量组2.2g・kg-1，低剂量组1.1g・kg-1），末次给药1h后进行腹主动脉采血，获得补肾活血中药含药血清。分别用这些含药血清培养p3代的大鼠BmSCs（药物组为10%的含药血清，对照组为10%的正常血清），观察其生长情况，发现含药血清组BmSCs的增速明显快于正常对照组，且与用药量基本成正比。张文信等[3]用金匮肾气丸复方含药血清对新西兰兔BmSCs进行体外干预，发现10%金匮肾气丸含药血清能够提高新西兰兔BmSCs的活性，促进Go/G1期的BmSCs向S期转化，最终促进BmSCs增殖。同样具有促BmSCs增殖作用的中药还有黄精[5]、菟丝子[6]、何首乌[7]、左归丸[8]、接骨散[9]、人参皂苷Rg1[10]、黄芪多糖[11]、羌活鱼[4]等。
机制：黄进等[6]认为，菟丝子之所以能促进BmSCs的增殖，可能与其促进了骨形态发生蛋白-2（Bmp-2）mRna的表达有关。另有研究[12]发现，龟板通过调控核转录因子e2F实现对BmSCs的促增殖作用。而何首乌[13]含药血清之所以具有促进大鼠BmSCs的增殖的作用，可能与其促进干细胞因子（SCF）mRna的表达有关。
2中药抑制BmSCs的凋亡
细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞程序性的死亡。研究表明，多种中药能够抑制BmSCs的凋亡。伏学坤等[14]将BmSCs在1%o2及无血清培养基条件下培养24h后，分别观察加或不加人参皂苷Rg1（ginsenosideRg1）时BmSCs的生长情况。结果发现加Rg1的高（500μg・L-1）、中（100μg・L-1）、低（10μg・L-1）剂量组BmSCs的凋亡率明显低于对照组，且剂量越高作用越明显。提示人参皂苷对低氧-无血清培养诱导的BmSCs的凋亡有一定的保护作用，即能抑制其凋亡。于勤等[15]研究发现，低（4mg・L-1）、中（40mg・L-1）剂量的薯蓣皂苷能够使缺血条件下p4代大鼠BmSCs的凋亡减少，表明其同样具有抗BmSCs凋亡的作用。其他如黄芪[16]、黄连素[17]等也能抑制BmSCs的凋亡。
机制：温肾补阳药含药血清[18]抑制BmSCs凋亡的作用机制主要是通过上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达，下调促进凋亡基因Bax的表达，从而降低BmSCs的凋亡率。黄连素[17]则是通过抑制正活性氧（RoS）的释放和c-Jun氨基末端激酶（JnK）的激活，从而减少凋亡相关蛋白CytC的释放以及Caspase-3的激活，最终发挥抗BmSCs凋亡的作用。
3中药诱导BmSCs的分化
3.1中药诱导BmSCs分化为成骨细胞曾建春等[19]用含10%肉苁蓉含药血清的L-Dmem培养基分别培养p4代大鼠BmSCs10，12，20d，发现到第10天时aLKp染色阳性，第12天可见白色钙结节，第20天茜素红染色阳性。表明肉苁蓉含药血清有诱导BmSCs成骨分化的作用。史春民等[20]用10.0，1.0，0.1mmol・L-1的异补骨脂素分别处理在成骨诱导培养液中培养的po代大鼠BmSCs，发现3个浓度的异补骨脂素均能够促进大鼠的BmSCs向成骨细胞方向分化，且浓度为1.0mmol・L-1的异补骨脂素的作用最佳。除此之外，具有此作用的中药或中药提取物还有土鳖虫[21]、接骨散[9]、杜仲叶提取物[22]、淫羊藿苷[23]、淫羊藿次苷ii[24]等。
机制：张贤等[25]在研究杜仲醇提取物诱导BmSCs成骨分化过程中，发现SD大鼠BmSCs经诱导3d后，wnt信号通路相关基因Fzd2，Fzd3，β-catenin，wiF1的表达量均有显著变化，提示wnt信号途径可能参与了杜仲醇诱导BmSCs成骨分化的过程。川续断皂苷[26]诱导BmSCs成骨分化的机制可能与升高核心结合因子α-1（Cbfα1）的表达量有关，而中药骨康方[27]通过激活p38-mapK信号通路以及促进Cbfal的表达诱导去势大鼠BmSCs的成骨分化。云南白药含药血清[28-29]促进BmSCs成骨分化的机制可能与影响Bmp-Smad信号通路、p38-mark信号通路等相关因子的表达有关。
3.2中药诱导BmSCs分化为软骨细胞研究者将0.5%的复方丹参注射液加到p3代大鼠BmSCs培养体系中，发现其不但能够明显促进BmSCs的增殖，还能促进其向软骨细胞分化[30]。Xiu等[31]用含10g・L-1鹿茸多肽的培养液培养p3代兔BmSCs，探讨鹿茸多肽对BmSCs软骨分化的影响，结果发现其对BmSCs向软骨细胞分化具有明显的促进作用。文献报道强肌健力饮[12]、复方透骨消痛颗粒[32]等也有诱导BmSCs软骨分化的作用。
机制：透骨消痛颗粒[32]能增加BmSCs中Ⅱ型胶原的表达，提示其促进BmSCs软骨分化的机制可能与促进Ⅱ型胶原表达量的升高有关。另有研究[12]发现，强肌健力饮中的一种化合物K9可能启动了BmSCs的软骨分化过程，且其机制可能与SHH信号通路有关。
3.3中药诱导BmSCs分化为心肌样细胞李志泉等[33]设计实验观察三七总皂苷（pnS）能否诱导BmSCs分化为心肌样细胞，发现150g・L-1的pnS能使p8代大鼠BmSCs的呈结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白（ctni）、α-心肌球蛋白重链（α-mHC）、β-心肌球蛋白重链（β-mHC）的表达呈阳性，表明pnS具有诱导BmSCs分化为心肌样细胞的作用。冼绍祥等[34]研究发现，终浓度为250g・L-1的黄芪甲苷可定向诱导p3代大鼠BmSCs分化为心肌样细胞。其他如复方丹参滴丸[35]、人参总皂苷[36]等也可诱导BmSCs分化为心肌样细胞。
机制：诱导BmSCs向心肌样细胞分化的作用多与抗氧化或促进某些诱导因子的产生有关，但具体机制有待进一步研究[37]。也有研究发现复方丹参滴丸[35]诱导BmSCs向心肌样细胞分化的同时，间隙连接蛋白CX-43表达上调，提示其作用机制可能与这一变化有关。
3.4中药诱导BmSCs分化为神经元样细胞Lu等[38]以丹参注射液作诱导剂干预p5代的大鼠BmSCs，探讨丹参能否诱导BmSCs向神经元样细胞分化，研究者将125μL丹参注射液与L-Dmem培养基混合，诱导BmSCs90min后，免疫组化检测到神经烯醇化酶（nSe）、胶质纤维酸性蛋白（GFap）的表达均呈阳性，提示丹参有诱导大鼠BmSCs向神经元样细胞分化的作用。研究发现，川芎嗪[39]、黄芪[40]、人参总皂苷[41]等也能诱导大鼠BmSCs向神经元样细胞方向分化。
机制：陈亚男等[42]发现红景天苷能够激活胞外信号调节激酶1/2（eRK1/2）以及另外3个信号通路，即pi3K/aKt/mtoR，进而诱导BmSCs向神经元样细胞分化，提示其机制可能与这些通路有关。而裴晶晶等[43]认为红景天苷诱导BmSCs分化为神经细胞的过程与Ca2+密切相关。该实验组先用红景天苷诱导BmSCs12h，再分别加入含eGta（细胞外Ca2+螯合剂）、nifedipine（L型Ca2+通道阻断剂）、LY294002（ip3受体阻断剂）分别阻断细胞外Ca2+、L型Ca2+通道、ip3受体，结果发现在不加阻断剂的情况下红景天苷能够诱导BmSCs向神经元样细胞分化，而加阻断剂后神经元特异性烯醇化酶和nurr1基因、蛋白的表达均显著下调，神经元样细胞分化受到抑制。提示红景天苷诱导BmSCs向神经元样细胞分化的机制与Ca2+有关。
4小结
综上所述，多种中药或中药提取物能够影响BmSCs的增殖、凋亡或分化，且有的不止有一种作用。如黄芪不仅能够促进BmSCs的增殖，还能抑制其凋亡[11，16]；人参皂苷不仅能够促进BmSCs的增殖，还能诱导其向神经元样细胞以及心肌样细胞分化[10，36，41]；鹿茸多肽不仅能够抑制BmSCs的凋亡，还能诱导其成软骨分化[14，31]。
从已有的报道来看，在中医上具有“补肾”、“壮阳”、“补气”、“补血”等补益作用的中药多能促进BmSCs的增殖、抑制其凋亡或诱导其分化。其中，具有“补肾”、“壮阳”作用的中药或其提取物多能够诱导BmSCs成骨分化，如肉苁蓉[19]、淫羊藿苷[23]、淫羊藿次苷Ⅱ[24]、杜仲[22]等，这与中医上强调的“肾主骨”的理论十分契合；具有“补气”、“补血”作用的中药或其提取物多能诱导BmSCs向心肌样细胞分化，如三七总皂苷[33]、黄芪甲苷[34]、复方丹参滴丸[35]、人参总皂苷[36]等，这与中医上强调的“心主血脉”、“气为血之帅”等理论也极为相符。揭示中医中药在BmSCs的研究中大有潜力可挖掘。
5问题与展望
尽管本领域的研究取得了上述令人鼓舞的进展，但也存在诸多问题。一是中药有效成分的问题。中药成分复杂，而产生相关药理作用的活性成分可能只有一种或几种，当前本领域的大部分研究缺乏对有效成分的深入探讨。二是机制研究的问题。多数研究只对作用进行了研究而未对相应的机制进行探讨，或仅开展了初浅的机制研究。三是BmSCs的体外培养、鉴定的问题。BmSCs的体外培养、鉴定等存在诸多问题，尤其是目前没有找到其特有的表面标记物[44]，使其鉴定还不能形成统一的标准。四是中药含药血清制备的问题。1988年日本学者田代真一首次提出“血清药理学”的概念[45]，6年后国内首次报道关于中药含药血清的研究[46]，含药血清的应用得到国内中药研究领域的广泛认可。本领域的研究也多采用了血清药理学的方法，但尚存在诸多问题。如：①“等浓”的问题。培养基稀释了含药血清的浓度，以至于细胞的体外培养无法有效模拟体内的反应。为了解决这个问题，研究者多会采用加大给药剂量的方法来实现“等浓”的效果。但此方法都有其自身的局限性，如血药浓度并不是随着给药剂量的提高而呈现线性变化[47]。②采血的问题。药物、采血方法、采血时间等多种变量可能导致血清有效活性物质的含量不尽相同。③灭活的问题。对于含药血清是否需要灭活存在诸多问题。如灭活可能会导致血清中一些稳定性差的活性成分失活，进而影响实验结果[48]。
众所周知，BmSCs是组织工程中比较理想的种子细胞，研究中药对BmSCs生命活动的影响，对我国的中医药事业将产生良好的推动作用，在细胞工程、组织工程、重大疾病研究等领域有广阔的应用前景。比如，利用某些中药具有促进BmSCs增殖的作用特点，可以将其应用到组织工程中对之进行安全有效的体外扩增，从而为科研、临床提供大量的种子细胞；利用某些中药可以诱导BmSCs成骨、成软骨分化的特点，可以为快速治疗骨折、骨缺损、骨质疏松等骨科疾病提供新的思路；利用中药诱导BmSCs分化为心肌样细胞的特点，可用干细胞移植的方法重建心肌细胞，这种方法安全、有效，可能是解决心肌梗死这一难题的有效途径[49]；利用中药诱导BmSCs成神经样细胞分化的功能特点，可能对神经系统疾病的治疗产生积极的意义。
[参考文献]
[1]FriedensteinaJ，petrakovaKV，Kurolesovaai，etal.Heterotopicofbonemarrow.analysisofprecursorcellsforosteogenicandhematopoietictissues[J].transplantation，1968，6（2）：230.
[2]曾意荣，樊粤光，刘红，等.补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响[J].中药新药与临床药理，2007，18（2）：93.
[3]张文信，刘金文，曹学伟，等.金匮肾气丸含药血清对体外兔BmSCs增殖细胞周期及凋亡的影响[J].辽宁中医杂志，2011，38（8）：1511.
[4]谢兴文，许伟，李宁.羌活鱼含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（32）：6016.
[5]黄进，张进，徐志伟.黄精含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（49）：9221.
[6]黄进，张进，徐志伟.菟丝子含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制[J].中华中医药杂志，2011，26（4）：818.
[7]张进，黄进，徐志伟.何首乌提取物及其含药血清对mSCs增殖的影响[J].时珍国医国药，2010，21（11）：2732.
[8]谭峰，樊巧玲，王明艳，等.左归丸对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（13）：145.
[9]谢兴文，宋敏，金成强，等.接骨散含药血清对骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化影响[J].中国中医骨伤科杂志，2011，19（6）：1.
[10]王力，吴鑫，卢新政，等.人参皂苷Rg1对培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖影响的机制研究[J].中国药理学通报，2007，23（1）：1480.
[11]黄进，张进，徐志伟.黄芪多糖对体外培养骨髓间充质干细胞增殖和干细胞因子表达的刺激作用[J].复旦学报：医学版，2011，38（4）：343.
[12]吴静.龟板和强肌健力饮对骨髓间充质干细胞增殖与软骨分化的影响[D].广州：广州中医药大学，2010.
[13]张进，黄进，徐志伟.何首乌含药血清促进mSCs增殖的效应及机理研究[J].中药新药与临床药理，2011，22（1）：12.
[14]伏学坤，郑惠珍.人参皂苷Rg1对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的保护作用[J].中国临床医师杂志，2013，7（8）：3454.
[15]于勤，方唯一，邹云增，等.薯蓣皂甙对骨髓间充质干细胞凋亡保护的研究[J].中国临床医学，2008，15（6）：904.
[16]郝崇伟.黄芪注射液对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响[D].衡阳：南华大学，2008.
[17]张伟.黄连素减轻缺氧无血清诱导的骨髓间充质干细胞凋亡以及减轻四氯化碳诱导的急性肝损伤[D].南京：南京医科大学，2010.
[18]杨黎丽，黄胜杰，李媚，等.温阳补肾药对抗骨髓间充质干细胞凋亡的实验研究[J].中医正骨，2013，25（2）：3.
[19]曾建春，樊粤光，刘建仁，等.肉苁蓉含药血清诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化的实验研究[J].中国骨伤，2010，23（8）：606.
[20]史春民，王拥军，苗登顺.异补骨脂素促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化并抑制其向脂肪细胞分化[J].南京医科大学学报，2011，31（5）：606.
[21]李树强，于涛，齐振熙，等.土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].中国骨伤，2010，23（12）：921.
[22]陈伟才，罗军.杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（10）：1960.
[23]翟远坤，王鸣刚，李志忠，等.淫羊藿苷含药血清对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨性分化的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（2）：480.
[24]翟远坤，陈克明，葛宝丰，等.淫羊藿次苷Ⅱ通过激活雌激素信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化[J].中国药理学通报，2011，27（10）：1451.
[25]张贤，朱丽华，钱晓伟，等.杜仲醇提取物诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的wnt信号途径[J].中国组织工程研究，2012，16（45）：8520.
[26]武密山，赵素芝，任立中，等.川续断皂苷Vi诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究[J].中国药理学通报，2012，28（2）：222.
[27]龚建文.从p38信号通路探讨中药骨康方对去势大鼠mSCs成骨分化的机制研究[D].广州：广州中医药大学，2011.
[28]张莹.云南白药含药血清对大鼠BmSC向成骨分化的作用机制研究[D].昆明：昆明医科大学，2012.
[29]张昕.云南白药含药血清促进大鼠BmSCs成骨分化机制的研究[D].昆明：昆明医科大学，2013.
[30]周信.针药结合诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的实验研究[D].南京：南京中医药大学，2011.
[31]XiuZB，LinJH，wuZY，etal.effectofpiloseantlerpolypeptidesonchondrogenicphenotypedifferentiationofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsinvitro[J].JClinRehabilittissueenginRes，2011，15（19）：3563.
[32]吴追乐，刘献祥，李西海，等.透骨消痛颗粒诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（33）：6456.
[33]李志泉，冼绍祥，汪朝晖，等.三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响[J].广州中医药大学学报，2007，24（6）：470.
[34]冼绍祥，杨忠奇，汪朝晖，等.黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J].广州中医药大学学报，2007，24（1）：37.
[35]李艳芬，孙兰军，赵英强，等.复方丹参滴丸干预骨髓间充质干细胞移植后心肌再生的实验研究[J].中国中医药现代远程教育，2009，7（9）：81.
[36]汪朝晖，洗绍祥，杨忠奇，等.人参总皂甙诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J].广州中医药大学学报，2006，23（2）：100.
[37]王新华，王士雯，李泱，等.地黄低聚糖诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究[J].医学杂志，2009，34（4）：412.
[38]LuCQ，RanL，ZhangQB，etal.Geneexpressionindifferentiationofratbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsintoneurocyte-likecellsinducedbysalviamitiorrhiza[J].JClinRehabilittissueenginRes，2008，12（47）：9363.
[39]陈兵，尹延庆，柯俊龙，等.川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞：最佳诱导剂量筛选[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（6）：1072.
[40]王新生，崔慧先，马海东，等.黄芪诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化[J].解剖学杂志，2007，30（5）：534.
[41]郑国庆，王小同，邬伟，等.人参总皂苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞[J].中华中医药学刊，2008，26（6）：1257.
[42]陈亚男，刘辉，赵红斌，等.红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的机制研究[J].药学学报，2013，48（8）：1247.
[43]裴晶晶，吴润，赵红斌，等.Ca2+信号介导红景天苷促进小鼠骨髓间向神经细胞的定向分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2013，14（10）：1808.
[44]左彬.SD大鼠骨髓间充质干细胞（BmSCs）体外培养方法改良[D].郑州：郑州大学，2013.
[45]田代真一.“血清药理学”と“血清药化学”一汉方の药理学かぅ始まつた药物血中浓度测定の新しぃ世界[J].tDm研究，1988（5）：54.
[46]杨奎，张德波，史焱，等.含黄芩血清及黄芩甙影响内生致热原产生的研究[J].中药药理与临床，1994，10（6）：13.
[47]吴健宇，穆静，李仪奎.血清药理学方法体外实验系统的血清添加量问题[J].上海中医药杂志，2001，9：8.
[48]陈赐慧，花宝金.关于中药血清药理学实验的几个问题和探讨[J].中华中医药学刊，2013，31（1）：46.
[49]谭琦.加味丹参饮诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[D].长沙：湖南中医药大学，2008.
ResearchprogressoneffectsoftraditionalChinesemedicinesonproliferation，
apoptosisanddifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcells
FanGJian-kang，ZHoUYi-ping，Lima-lin
（1.SchooloftraditionalChinesemedicine，YunnanUniversityoftraditionalChinesemedicine，Kunming650500，China；
2.SchoolofpharmaceuticalScience&KeyLaboratoryofpharmacologyfornaturalproducts，
KunmingmedicalUniversity，Kunming650500，China）
[abstract]Bonemarrowmesenchymalstemcells（BmSCs）areakindofpluripotentstemcellsderivedfrombonemarrows，whichcannotonlysupporthematopoiesis，butalsohavecapabilitiesofmultidifferentiation，high-proliferationandself-renewing.theyhavebecomeoneofhotspotsinstemcellstudies.StudiesoninvitrointerventionwithBmSCswithtCmshavemaderemarkableprogressinrecentyears.accordingtothefindings，sometraditionalChinesemedicinescanpromoteproliferationofBmSCs，somecaninhibittheapoptosisofBmSCs，whileotherscaninduceBmSCstodifferentiateintomultiplecelltypes，suchasosteoblast.Furthermore，somestudiesalsoinvolvedrelevantactionmechanisms.theauthorssummarizedtheadvanceinrelevantstudiesbyreferencetorelevantliteraturesofthisfield.
细胞生物学研究方向篇5
[关键词]外胚层间充质干细胞；鼻黏膜；诱导；分化；成骨细胞
[中图分类号]R329.2[文献标识码]a[文章编号]1674-4721（2016）08（b）-0029-05
[abstract]objectivetoinvestigatetheeffectoftheinductionanddifferentiationofectomesenchymalstemcellsderivedfromnasalmucosaintoosteoblast.methodsthenasalmucosaofSDratwascollectedandtheectomesenchymalstemcellsderivedfromnasalmucosawereculturedinvitro.thecellsurfacemarkersCD45-FitC，CD14-pe，CD105-pe，CD34-pe，CD71-pe，CD34-pe，CD44-pewereidentified，andthecellsweretakenosteogenicinduction.afterinductionanddifferentiationofosteoblast，thechangesofalkalinephosphataseactivitiesindifferenttimeweredetected，andthecellsweretakenalizarinredstaining，theeffectsofinductionanddifferentiationofcellswereobserved.Resultsthroughinductionanddifferentiationofosteoblast，thealkalinephosphataseactivitiesofectomesenchymalstemcellsderivedfromnasalmucosawereincreasedsignificantlyafterinductionfor4d，whichreachedmaximumvalueat7danddecreasedgraduallylater.afterosteogenicinductionfor21d，theectomesenchymalstemcellsderivedfromnasalmucosabyalizarinredstainingshowedpositiveresults，extracellularmatrixshowedcalciumdepositandtheformationofcalciumnodule.Conclusiontherearesomeectomesenchymalstemcells′inthenasalmucosaofrats，thecellshavetheabilityofdifferentiationandcanbedifferentiatedintoosteoblaststhroughinductionanddifferentiation，whichhascertainclinicalapplicationprospects.
[Keywords]ectomesenchymalstemcells；nasalmucosa；induction；Differentiation；osteoblast
干细胞具有自我更新和自我分化能力，可以在一定的条件下分化为多种不同类型的细胞，应用于临床各种疾病的治疗之中[1]。外胚层来源的间充质干细胞是一种重要的干细胞类型，在一定的体外条件下也可以发生分化[2-3]。分化的细胞可以有多种类型，包括成骨细胞和脂肪细胞以及神经细胞等。其中，成骨细胞在临床的应用十分广泛。外胚层间充质干细胞主要存在于头面部黏膜固有层中，其中，鼻黏膜是一个重要的细胞来源，可以分化为不同的细胞[4]。但是，关于鼻黏膜来源的外胚层间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导及分化问题，相关的研究和报道较少。本研究探讨鼻黏膜外胚层间充质干细胞经诱导分化为成骨细胞的效果，以期为临床治疗提供一定的实验依据。
1材料与方法
1.1材料
纳入SD大鼠5只，体重300g左右，均为雄性，健康状况良好。实验动物均由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）2014-0006。本研究相关方案均提交医院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。
1.2方法
1.2.1大鼠鼻黏膜收集[5]对SD大鼠进行戊巴比妥钠麻醉，达到麻醉效果之后处死。在超净工作台上剪下大鼠鼻道末端，收集1/3鼻中隔组织。将组织置于玻璃培养皿中，利用pBS进行3次洗涤，并对鼻中隔表面呼吸黏膜进行分离。
1.2.2大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞培养[6]对上述步骤采集到的呼吸黏膜进行处理，利用眼科剪剪为小碎块，添加胰蛋白酶进行消化。置于37℃恒温箱中消化5min后取出，添加含有胎牛血清的Dmem/F12培养基终止消化。终止消化后进行离心，去掉上清，对细胞进行重悬，以1×106个/mL的浓度将细胞接种在培养瓶中，将培养瓶置入二氧化碳培养箱中进行常规原代和传代培养。
1.2.3细胞免疫表型鉴定[7-8]倒置显微镜下观察细胞生长情况，收集生长状态良好的p3细胞，分别用pe或FitC偶联的CD45-FitC、CD14-pe、CD105-pe、CD34-pe、CD71-pe、CD34-pe、CD44-pe对细胞进行标记，上流式细胞仪进行细胞免疫表型检测。
1.2.4大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞增殖情况检测[9]利用mtt法对细胞的增殖情况进行检测，收集p3细胞，胰蛋白酶消化之后制备细胞悬液，接种在96孔板中，添加完全培养基置于二氧化碳培养箱中进行培养。从接种后第1天起，每天取1板细胞，利用mtt法检对细胞增殖情况进行检测，使用酶联免疫检测仪检测各孔的光吸收值（oD值），连续监测7d。完成记录数据，并利用数据描绘出细胞的体外增殖曲线。
1.2.5大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化[10]间充质干细胞传至第3代，胰酶消化传代，接种于6孔板，进行成骨诱导培养，诱导培养基含有β-甘油磷酸钠和维生素C以及地塞米松，每3天更换1次培养基。
1.2.6大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导碱性磷酸酶的活性定量检测[11]收集诱导后间充质干细胞，胰酶消化，接种在培养板上。观察细胞融合情况，待达到100%之后利用对硝基苯棕榈酸酯法对碱性磷酸酶的活性进行定量检测，连续10d，利用试剂盒进行检测，记录检测结果。
1.2.7大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化细胞中钙结节的形成检测[12]大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导21d后，去除培养液，pBS洗涤之后利用乙醇进行固定，去离子水轻柔冲洗后添加茜素红染色液进行孵育。孵育结束吸除多余染色液，去离子水漂洗、振荡，最后置于镜下观察、拍照。
1.3观察指标
观察细胞培养形态和表面标志物鉴定结果，并对成骨诱导分化后细胞在不同时间的碱性磷酸酶活性变化情况进行检测。对细胞进行茜素红染色，观察细胞诱导分化效果。
2结果
2.1实验流程
实验流程见图1。
2.2大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞培养结果
接种后1d，细胞开始发生贴壁，大多数细胞呈梭形或椭圆形（图2a）。培养7d，细胞大部分融合（图2B）。传经代培养，细胞大多呈梭形或椭圆形，且呈现出较为一致的排列方向（图2C）。
2.3大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞鉴定结果
利用流式细胞仪对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞表面抗原进行检测，可得CD45、CD14、CD34、CD71均呈阴性表达，CD133、CD105、CD44均呈阳性表达。见表1。
2.4大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞体外增殖曲线
mtt法检测大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞不同时间oD值，描绘细胞增殖曲线，可得基本呈“S”型，1～3d曲线平稳上升，细胞缓慢增殖，4d开始曲线变得陡峭，细胞增殖速度明显加快，之后持续上升，并于7d开始下降。见图3。
2.5大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达水平
大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性在诱导4d后显著增加，并在7d达到最大值，之后逐渐下降。见图4。
2.6大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后钙结节染色情况
成骨诱导至21d，对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行茜素红染色之后可观察到结果呈现出阳性，细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节形成。见图5。
3讨论
间充质干细胞具有很强的多向分化潜能和自我增殖能力，可以在一定条件下发生分化。赵红斌等[13]报道，间充质干细胞可以向成骨细胞发生分化，且分化过程受到多种因素的影响，机械力可以通过Ca2+信号、细胞微丝结构以及pi3Ks信号途径导致一定应答反应和生物学效应的出现，进而影响到细胞的成骨分化。间充质干细胞具有不同的类型，不同的细胞类型均有可能分化为成骨细胞。鞠晓东等[14]收集3周龄Lewis大鼠腹股沟脂肪垫进行培养，成功获得脂肪间充质干细胞，并通过成骨诱导培养基培养，诱导细胞向成骨细胞方向发生分化。
外胚层间充质干细胞主要存在于头面部黏膜固有层中，具有一定的分化潜能，在一定的条件下可定向分化为不同的细胞类型，包括神经细胞和成骨细胞以及脂肪细胞等，具有较高的临床应用价值。以往王亦菁等[15]通过研究报道，牙髓干细胞、外胚间充质干细胞的细胞形态均与骨髓间充质干细胞十分相似，外胚间充质干细胞增殖能力较强，包含多种间充质类型细胞，有望成为临床口腔颌面部间充质干细胞的重要来源。在鼻中隔黏膜组织中，大的部分均属于呼吸黏膜，呼吸黏膜均起源于外胚层。在鼻黏膜中，可以获得一定的干细胞，相应的干细胞可以在一定条件下分化为不同的细胞类型。张健等[16]收集大鼠鼻甲组织，经分离、培养获得鼻黏膜来源干细胞，并利用成纤维细胞生长因子对细胞进行诱导，使之成功分化为施万样细胞。
本研究从SD大鼠鼻中隔收集呼吸黏膜，并通过体外培养，获得实验所需的外胚层间充质干细胞。对间充质干细胞进行鉴定的时候，常用的标志物包括CD133、CD105、CD44等。本研究结果显示，利用流式细胞仪对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞表面抗原进行检测，CD133、CD105、CD44均呈阳性表达，提示相应的细胞为外胚层间充质干细胞。间充质干细胞具有很强的多项分化潜能，实际应用过程中，可以按照实际需要，对细胞进行一定的定向诱导，促进其向一定的方向发生分化，获得所需细胞类型。在对鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行成骨诱导的时候，本研究参考以往学者的方法[17]，制备所需的诱导培养基。培养基中含有多种成分，包括β-甘油磷酸钠和维生素C以及地塞米松。其中，地塞米松可以对细胞各项活动予以有效的调节，维生素C可以参与到Ⅰ型胶原的早期合成环节之中，β-甘油磷酸钠可以参与到细胞外基质的矿化过程中[18]。在观察细胞成骨效果的过程中，可以选择对一定的指标进行观察。碱性磷酸酶是成骨细胞的一种重要组成成分，可以对参与骨代谢重要蛋白以及成骨细胞分化相关情况予以反映[19]。本研究结果显示，大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性在诱导4d呈现出显著增加的情况，并在7d达到最大值，之后逐渐下降。即提示，在经过一定的成骨诱导之后，细胞向成骨细胞方向进行分化。另外，成骨细胞可以分泌碱性磷酸酶，导致磷酸局部水平的上升。碱性磷酸酶在细胞外基质中的大量分泌会对细胞外基质矿化过程产生积极的促进作用，使得钙盐大量沉积[20]。本研究发现，成骨诱导至21d，对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行茜素红染色之后可观察到结果呈现出阳性，细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节形成。这一结果也进一步证明，在经过一定的成骨诱导之后，鼠鼻黏膜间充质干细胞向成骨细胞分化。
综上所述，通过本研究初步提示，在大鼠鼻黏膜中存在一定的外胚层间充质干细胞，该细胞具有分化潜能，可以经诱导分化为成骨细胞。另外，鼻黏膜取材方面，可以为临床细胞培养提供丰富的材料来源。为此，鼻黏膜来源的外胚层间充质干细胞具有一定的临床应用前景，关于其临床应用效果，还有待在今后予以进一步的分析。
[参考文献]
[1]赵曼竹，温秀杰，李刚，等.p75神经营养受体阳性外胚间充质干细胞的体外获取与生物学特性研究[J].中华口腔医学杂志，2015，50（2）：103-109.
[2]王亦菁，张晓东，孙B海，等.免疫磁珠筛选大鼠牙髓干细胞、外胚间充质干细胞的表型研究[J].口腔医学，2014，34（6）：454-456，480.
[3]丛姗，宋瑾，张惠娟，等.人羊膜间充质干细胞（hamSCs）的分离、体外培养及诱导分化[J].农业生物技术学报，2015，23（1）：20-31.
[4]张健.大鼠鼻粘膜来源外胚层间充质干细胞分化为施万样细胞及其功能研究[D].苏州：苏州大学，2014.
[5]贺清华，周月鹏，陈谦，等.大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞向成骨细胞和神经元的诱导分化[J].江苏大学学报：医学版，2011，21（3）：190-193.
[6]贺清华.大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞的生物学特性研究[D].镇江：江苏大学，2011.
[7]贺清华.大鼠鼻黏膜外胚间充质干细胞的干细胞特性研究及其在治疗脊髓损伤中的应用[D].镇江：江苏大学，2015.
[8]张积华，孙康，王妍，等.脐血间充质干细胞生物学特性及其成骨成脂分化潜能[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（27）：4984-4987.
[9]方颖，曾素娟，余，等.碱性成纤维生长因子对牙龈间充质干细胞生物学性能的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2015，25（11）：639-644.
[10]朱恒，刘元林，陈继德，等.向成骨细胞和成脂肪细胞分化的小鼠骨间充质干细胞调节单核细胞来源的破骨细胞发育[J].中国实验血液学杂志，2012，20（5）：1187-1190.
[11]孙国栋，伍时县，李志忠，等.人脐带间充质干细胞分离培养及成骨分化：原子力显微镜观察细胞膜表面的超微结构变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（1）：33-37.
[12]张健，高鑫，张志坚，等.鼻粘膜干细胞来源施万样细胞与pC12高分化细胞共培养研究[J].中国矫形外科杂志，2014，22（10）：911-917.
[13]赵红斌，吕同德，马敬，等.机械力对间充质干细胞向成骨细胞分化的力学响应机制研究[J].生物化学与生物物理进展，2007，34（7）：718-723.
[14]鞠晓东，娄思权，田华，等.脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究[J].中华实验外科杂志，2004，21（6）：654-656.
[15]王亦菁，张晓东，刘映霞，等.牙髓干细胞、外胚间充质干细胞生物学特性比较研究[J].临床口腔医学杂志，2013，29（4）：214-217.
[16]张健，高鑫，张志坚，等.鼻粘膜干细胞来源施万样细胞与pC12高分化细胞共培养研究[J].中国矫形外科杂志，2014，22（10）：911-917.
[17]owenta，aronowm，ShalhoubV，etal.progressivedevelopmentoftheratosteoblastphenotypeinvitro：reciprocalrelationshipsinexpressionofgenesassociatedwithosteoblastproliferationanddifferentiationduringformationoftheboneextracellularmatrix[J].JCellphysiol，1990，143（3）：420-430.
[18]赵勤鹏.定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨及成脂细胞的分化[J].中国组织工程研究，2015，19（32）：5103-5107.
[19]廖家成，贝抗胜，连银川，等.骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞碱性磷酸酶的表达[J].中国组织工程研究，2013，17（33）：5917-5922.
细胞生物学研究方向篇6
科学家们对细胞重编程的研究已持续了数十年。所谓细胞重编程，是指“已分化的特定细胞可以被重新编程为多功能的干细胞”。1962年，约翰・戈登在他的实验室里证明，已分化的动物体细胞在蛙卵中可以被重编程，从而发育成完整的个体，这样就证明了细胞的分化是可逆的。2006年，山中伸弥将戈登的这一成果推进了一大步，实现了细胞在体外的重编程，诱导出了具有多性的细胞（即诱导性多能干细胞，ipS细胞）。与胚胎干细胞相比，ipS细胞的优势在于它避开了从人体胚胎中提取干细胞的伦理道德制约，使干细胞研究能被所有人接受。同时，由于这些细胞来自于病人自身，在临床应用时有望能避免免疫系统对外来组织的排斥。ipS技术的创立开创了一个全新的研究领域。
敢于挑战的“克隆教父”
约翰・戈登（JohnB.Gurdon）是英国剑桥大学细胞生物学教授、戈登研究所所长，他还兼任了麦格达伦学院院长。1933年戈登出生于英国，先后在伊顿公学、牛津大学就读，并获得牛津大学生物学博士学位。
约翰・戈登教授的最初突破性发现已经是50年前的事情了。1962年，他发现细胞的特化是可逆的。在一项经典实验中，他将一个未成熟的青蛙卵细胞的细胞核用一个成熟的肠道细胞的细胞核进行替换。这个被改造过的卵细胞后来发育成了一只正常的蝌蚪。这一实验证明，一个成熟细胞中的Dna仍然储存有让一颗细胞发育成一只完整青蛙的所有信息密码。这项开创性的研究彻底颠覆了我们原先对于细胞发育和特化的认识。
我们所有人都是从一颗受精卵开始发育而来的。在受精之后的第一天，胚胎中所含有的是不成熟的细胞，但是，这些细胞最终可以分化，形成一个成年个体所具有的全部各种器官和组织。这些细胞就被称作多能干细胞。随着胚胎的进一步发育，这些细胞中逐渐分化出神经细胞、肌肉细胞、肝细胞以及所有其他种类的细胞――所有这些细胞都已经特异化，具备了一种特别的功能，可以执行人体的各种不同的生理机能。这种从不成熟细胞到特异化成熟细胞的过程曾经被普遍认为是不可逆的。人们认为这是细胞的成熟过程，它们不可能重新回到多能干细胞的阶段。
约翰・戈登教授最先向这个生物学教条发起了挑战。他猜想在一颗成熟的细胞中应当仍然保存着形成所有其他细胞类型的所需信息。1962年，他对自己的这一猜想进行了实验验证。该实验打破了科学界普遍认为动物胚胎发育过程中的细胞分化是单向的、不可逆转的论断，证明该过程是可逆的。当戈登最初公布他的实验结果时，质疑声不断，但是，随着其他科学家重复他的实验并获得同样结果，这项研究结果开始逐步被人们接受。这证明体细胞核是可以在卵中被重编程为多能性细胞的。随后科学家们竞相投身这一领域的研究，相关的技术也飞速发展，并导致了对哺乳动物克隆的研究。
在现代生物医学领域里，戈登的研究是一个很重大的科学突破。一开始，没人赞同他的设想。面对质疑，他却能够力排众议，坚持自己的信念和实验结果。现在的克隆技术和干细胞治疗技术，都是因为他的理论才得以发展和成熟；也是由于他的坚持，才使我们获得了有关有机体和细胞发育方面的崭新认识，极大地帮助科学家们揭示疾病的发病机制，从而促成有关的新药研发。
少年时的“最差生”
戈登的这种勇于坚持和力排众议的个性可以追溯到少年时代。他曾经在一个新闻会上说，自己现在依然保存着当年的中学科学老师给他的评语：
我相信戈登有将来成为一位科学家的理想；根据他现在的表现，这个理想非常荒谬；如果他不能学会一些简单的生物学常识，他将来不会有任何机会去做专家级的工作，而且，不管对他自己还是教他的老师们来说，这纯粹是浪费时间。
当年，这位老师看不上眼的学生，今天竟然得到了诺贝尔生理医学奖，真是让人感慨万千。有志者事竟成，教育者千万不要过早给自己的弟子下结论。如今，已有不少人开始反思时下的中学教育。那份成绩报告单，一直被裱挂在戈登办公桌的正上方，他似乎从中得到了一些特别的动力。“有时我会看着它告诉自己，几十年前就有人说，你根本不擅长这个工作。”戈登说，“当你的实验遇到困境的时候，拿这个方法激励自己，真的太有效了，要不然就被老师说中了。”虽然成绩差、不被老师和学校看好，但戈登仍然坚持自己的想法，对生物学的热爱从不曾减少过半分。后来，戈登在一次被采访时回忆说，自己少年时被生物学深深吸引，甚至在学校养过上千只毛毛虫，并看着它们变成飞蛾，这在当时还引起了老师的强烈反感。
开着破车上班的名人
戈登的一名学生回忆第一次见导师时的情景：当一辆很破旧的汽车迎面驶来时，他根本想不到这位大名鼎鼎的发育生物学家就驾驶着这样老旧的汽车。当时戈登的名气已经很大，在剑桥有一个研究院都是以他的名字命名的，可是他还是为人低调，生活简朴。通常科学家到了一定的年纪，会选择发表文章、教书为主业，很少会去继续做实验，但戈登已70多岁的高龄，仍然坚守实验室，这次诺贝尔获奖电话也是他在实验室里接听的。当时一名英国记者曾试图联系戈登进行连线采访，但戈登的实验室答复称：“戈登正在工作，请不要打扰他。”没有被盛名所累，一直保持勤奋严谨的态度，戈登绝对堪称一位大家。
“笨手笨脚”的外科医生
在戈登那项开创性的实验之后，全球的生物学研究都在沿着他开拓的路径一往直前，当然除了备受争议的克隆技术。2006年，日本科学家山中伸弥也从人类的皮肤细胞中，培养出了尚未分化的干细胞，把这项研究推到了一个新的高度。
山中伸弥，1962年出生于日本大阪府，大阪市立大学医学博士（1993年），京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授，美国加利福尼亚州旧金山心血管疾病研究所高级研究员。
无独有偶，与戈登少年时代的遭遇类似，山中也是一位后进学生。他在中学时学习也并不专心，酷爱柔道和棒球，甚至为此骨折了10多次。毕业时，父亲告诉他：你多次受伤，看见医生怎样为病人减轻痛苦，你将来要做医生为人类服务。于是山中就接受了父亲的提议，在学校的最后阶段认真学习，终于考入了著名的国立神户大学医学部，并努力成为了一名外科医生。但是，他拙于动手的弱点，让他成为同事们的笑柄。山中每次回忆自己从神户大学医学院毕业后做的第一次手术，都颇有感慨。那是一次良性瘤移除手术，熟练的医生10分钟就可以做完，但山中折腾了一个小时也没有完成。
山中还曾给父亲打过针。山中说，父亲当时看起来很高兴，但实际很疼：“儿子，你不擅长这个，对吧？”由于山中临床动手能力笨拙，有些人甚至送给了他一个外号――绊脚石。不过，失败是成功之母，山中也因此放弃了临床医生的职业，寻找发展自己事业的新契机。
放弃高薪转投研究
山中伸弥从大阪市立大学博士毕业以后，认为日本国内的研究环境不够完善，于是他就去美国的格莱斯顿研究所留学，在那里接触了单性干细胞（万能细胞），从此决定了他的研究方向。那里自由的学术气氛和良好的研究平台，让山中更充分地发挥了自己的研究才能。
“美国多见一种‘开放式实验室’的研究方式，不论是价格高昂的装置还是研究者的智慧都是共享的。而在日本国内，很少有这种开放式研究。”山中说。
几年后，山中返回日本医学界，准备继续研究时，却发现这里的研究条件比美国差太多，资金不到位，培育小白鼠的时间甚至比做实验的时间还长，甚至还得亲自动手培养。“为什么我要不停更换小白鼠的笼子？”山中抱怨道。面对这种境况，山中感到了绝望，甚至得了忧郁症。这时，山中曾经与家人商量，是不是让他放弃基础研究，去当收入比较高的临床医生。在日本，医生是一个收入十分丰厚的职业。而山中的夫人也是一位皮肤科的医生，她对山中教授的研究全力支持。如果没有贤内助的支持，也没有今天获奖的山中教授。
在家人的理解和支持下，山中最终克服了困难，选择了坚持做研究。1999年，他向奈良科学与技术学院申请助教授职位。当时的一名教授回忆，在众多应聘者中，山中是唯一愿意接受长远挑战的人，因为其他应聘者都选择了明显能在数年内见成果的研究项目，而他则选择了干细胞研究。
“ipS”细胞的发现进程
2004年，山中教授前往京都大学继续研究万能细胞。2006年他发现了4种重要的遗传因子，并且利用试验老鼠研制出可以多种变化的万能细胞，正式取名ipS细胞（人工多功能干细胞）。这意味着未成熟的细胞能够发展成所有类型的细胞。
山中历来喜欢开玩笑，在获奖记者招待会上，他介绍了自己研发出这一让世界震惊的人工多能干细胞（ipS细胞）的过程。他笑言，ipS（inducedpluripotentstemcells，诱导多能干细胞）在2006年命名期间，当时苹果公司的ipod播放器十分流行，所以他希望ipS诱导多功能干细胞能沾沾ipod的光，被人们熟知，而采用了小写的“i”字母作为首写字母。
事实证明这4个基因中，其中一个基因确实是“一次天大的冒险”，因为这一个是与癌症相关的基因。数月后他又发现即使不使用这个致癌基因，他仍然能够重组细胞，这样癌变的几率会大大降低。但新创造的干细胞仍然会发生癌变，在他的实验中，121只老鼠中，有20%产生了肿瘤。这说明使用逆转录病毒，可能使基因产生变异，引发肿瘤等副作用。他表示下一步的研究目标是在不使用逆转录酶的情况下实现细胞重组。
表皮细胞经诱导后，具有胚胎干细胞的特征，可转变为心脏和神经细胞，这为研究治疗目前多种心血管绝症提供了巨大助力。这一研究成果在全世界被广泛应用，因为其免除了使用人体胚胎提取干细胞的伦理道德制约。山中也因此获得了世界各地多次颁发的医学奖项。
细胞重编程的应用价值
ipS技术的出现挽救了整个干细胞事业。这一新的细胞重编程的方法绕过了胚胎干细胞的伦理困境，把病人的体细胞转化为干细胞供自身使用，开创了基因治疗的新方法。2007年，鲁道夫・詹尼士（RudolfJaenisch）研究组利用ipS重编程技术，成功治疗了小鼠的镰状红细胞贫血症。他们用患有镰刀型贫血症的小鼠体细胞建立了ipS细胞，并通过基因技术修正细胞中的疾病基因。将修复后的ipS细胞诱导分化为血液干细胞后移植回患病小鼠体内，可以改善小鼠的贫血症状。2009年初，另一些研究人员用从ipS细胞诱导来的内皮前体细胞和内皮细胞成功治疗了血友病。他们的研究虽然是在小鼠中进行的，然而，这些成果证实ipS细胞在基因治疗中的可行性，从实践上为人类基因遗传病的治疗奠定了基础。到目前为止，利用ipS细胞进行疾病研究已经在许多疾病上开展起来。
细胞生物学研究方向篇7
1细胞共培养的方法
细胞共培养技术目前应用的方法可分为单层混合共培养技术、非接触式共培养技术和组织工程支架技术。单层共培养是将两种以上细胞放入同一器皿中共同培养的方法,非接触式共培养是通过transwell小室来实现的。将transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下室以聚碳酸酯膜相隔,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。组织工程支架技术是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上,使细胞在支架上增殖、分化[6]。现阶段美白药物筛选常用的是单层混合共培养技术,非接触式共培养还未见用于美白药物筛选,而组织工程支架技术中的皮肤类似物将可能成为发展方向。
2细胞共培养技术在美白药物筛选领域的应用及发展
黑素合成和转运的每一个过程都有着精细的调控机制,其中任何一个环节出现结构和功能的异常,都有可能引起皮肤色素异常性改变[7-9]。黑素生成是发生于黑素细胞的细胞器黑素小体,此过程包括黑素小体的形成和在L-酪氨酸酶作用下转化成为黑素的生化途径。酪氨酸酶是这一生物合成过程的关键酶,其活性与黑素合成量密切相关,控制其活力即可控制黑素生成量。因此,可通过抑制酪氨酸酶活性和黑素生成量来筛选美白药物,黑素细胞单独培养或黑素细胞与角质形成细胞共培养将是美白中药筛选的有效途径。
大量学者尝试通过黑素细胞单独培养来筛选能够使黑素合成、转运受阻的美白药物。杨壮群等[1,10-12]均通过单独培养黑素细胞筛选出有些中药提取物可以抑制酪氨酸酶活性、降低黑素含量,表明单独培养黑素细胞是一种筛选美白药物行之有效的方法。但随着对皮肤构造的深入了解,研究者意识到与黑素细胞相连的角质形成细胞对其发挥的作用不容忽视,罗增香等[13]通过中药单体蛇床子素、黄芩苷对黑素合成的研究发现,共培养体系中药物对黑素合成的抑制作用强于单独培养的黑素细胞,说明了两种培养方法确实存在差别。由于细胞共培养体系更接近正常人皮肤的真实构造,得出的数据更有说服力,所以研究者便把筛选药物的方法从黑素细胞单独培养向黑素细胞和角质形成细胞共培养过度,而更接近人体皮肤结构的皮肤类似物也有希望成为美白药物筛选的新方法。
2.1单层混合共培养的应用:单层混合共培养是将所研究的不同种类的细胞在同一培养器皿中混合培养。它提供了类似体内的复杂微环境,包括细胞与细胞间的接触反应和细胞因子的作用。由于其操作简便,目前广泛应用于模拟人表皮微环境的实验研究。1988年,Halaban[14]首次成功地将黑素细胞和角质形成细胞共培养,验证了该模型的可行性。马慧军等[15]也成功建立了人表皮原代黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,为美白药物的筛选提供了可行的方法。仲少敏等[16]选取85种生药醇提物和水提物在melan-a与Sp-1共培养体系做实验研究,熊果苷作为阳性对照,结果川芎、威灵仙、桂枝、麦冬、白果、蒿本、红花、白苏叶的醇提物,五倍子的水提物在细胞培养水平对黑素生成有明显抑制作用,强于相同浓度熊果苷的作用,这一结果可为美白药物筛选提供依据。兰海龙等[17]以人包皮组织作为细胞来源,体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型,检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响,发现三种单体均对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成产生浓度依赖性抑制,初步阐明了美白药物的作用机理。解士海[4]通过建立人表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养的体外模型,研究了丹皮酚、苦参碱、氧化苦参碱、大黄素等中药单体对黑素合成过程的影响,结果表明通过观察黑素小体的转运证明了共培养模型的成功建立;熊果苷、丹皮酚、苦参碱剂量依赖性抑制共培养体系中黑素小体的转运;大黄素、氧化苦参碱对于黑素小体的转运无影响,表明丹皮酚具有很好的美白应用开发前景,大黄素及苦参碱有待进一步研究。左付国[9]建立了人的黑素细胞与角质形成细胞共培养模型,研究了熊果苷和淫羊藿苷两种中药单体对黑素小体转运的影响及其可能的作用机制,发现熊果苷可通过诱导黑素细胞树突退缩,抑制黑素小体的转运,这一研究结果为熊果苷作为美白药物提供了一项新的依据。
2.2皮肤类似物的应用前景:单层混合共培养模型可以对美白药物进行有效的筛选,但tae-JinYoon等[18]通过实验证明了黑素瘤细胞或黑素细胞单独培养或是与角质形成细胞共培养得到的数据与三维皮肤类似物的均有不同,而皮肤类似物更能准确地表现组织学构造,所以皮肤类似物模型,有望用于中药美白药物的大范围筛选,提高工作效率。人类正常皮肤主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主,其中Ⅰ型胶原含量最多,由于胶原分子结构中含有大量的双羧基及双氨基氨基酸和碳水化合物,适于细胞的粘附;胶原又是一种广泛存在于动物皮肤、肌腱和其他结缔组织中的天然蛋白质,来源广泛。因此,在胶原重组膜上接种人黑素细胞和角质形成细胞可以建立皮肤类似物模型。Lee等[19]利用含角质形成细胞和黑素细胞的皮肤类似物模型检测化合物光毒性,结果显示光生物学效应与天然皮肤很接近;Damour等[20]很早便指出组织工程皮肤将成为评估化妆品原料及产品皮肤刺激、光毒性、光保护等特征的有用工具,这都为皮肤类似物模型成为筛选美白中药的有效途径提供了依据。杨颖等[21-22]分别从胎牛皮和大鼠鼠尾腱中提取胶原纤维,再经处理制成生物相容性良好的胶原作为支架,在支架材料上种植成纤维细胞构建皮肤类似物模型。杨壮群等[23-24]通过人永生化表皮细胞(HaCat)和黑素细胞共培养体系接种在鼠尾胶原凝胶支架上构建皮肤类似物模型。张铁良等[25]将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、naoH溶液和以血清重悬的成纤维细胞溶液在适当的比例下混合后形成凝胶构建真皮类似物。刘源等[26]也运用组织工程方法以包皮组织作为细胞来源构建含有黑素细胞的皮肤类似物模型。虽然以上皮肤类似物模型的建立多是用于研究皮肤缺损的修复,美白中药筛选还未有人使用这种模型,但由于皮肤类似物模型有可能与人皮肤组织融合,将使得中药美白药物筛选的数据更加可靠,筛选方法更加有效,可以作为美白药物筛选的新尝试。
3小结
现今,通过细胞共培养技术筛选美白药物已成为研究的热点。细胞共培养技术经历了单层细胞的接触、非接触式共培养到三维皮肤类似物,共培养方法已日趋成熟。单层细胞共培养由于操作简单适合于实验室中药物筛选的研究,而且该模型接近真实的人体生理环境,使研究者能够更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点,填补了一种细胞单独培养和整体动物实验的空白[27],用此方法已筛选出了许多有效的中药提取物,有些已用于美白产品中。而三维皮肤类似物模型由于已验证了它与人类缺损皮肤的融合能力,证明了它与正常人皮肤具有良好的相似度,用该模型进行药物筛选得到的结果将更具有可信度。如果能够商品化皮肤类似物,将为中药美白药物的筛选提供一个更方便、快捷、有效的途径[28]。共培养技术的不断发展给研究者带来了新的机遇与挑战,在研究者的共同努力下将会得到更加方便、有效的药物筛选方法。
[参考文献]
[1]杨壮群,王正辉,荔鹏,等.芦荟苦素对体外培养的黑素细胞影响的实验研究[J].中国美容医学,2003,12(05):464-466.
[2]雷铁池,朱文元,夏明玉,等.中药对黑素生物合成影响研究:82味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].中草药,1999,30(5):336-339.
[3]解士海,陈志强,马鹏程,等.人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察[J].临床皮肤科杂志,2006,35(5):286-288.
[4]解士海.人表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养及11种化合物对黑素沉着的影响研究[D].中国协和医科大学,2006.
[5]YoontJ,HearingVJ.Co-cultureofmouseepidermalcellsforstudiesofpigmentation[J].pigmentCellResearch,2003,16(2):159-163.
[6]吴林波,丁建东.组织工程三维多孔支架的制备方法和技术进展[J].功能高分子学报,2003,16(1):91-96.
[7]Dell'annamL,picardom.areviewandanewhypothesisfornon-immunologicalpathogeneticmechanismsinvitiligo[J].pigmentCellResearch,2006,19(5):406-411.
[8]LinJY,FisherDe.melanocytebiologyandskinpigmentation[J].nature,2007,445(7):843-850.
[9]左付国.Rho-Gtpase调节人黑素细胞和B16黑素瘤细胞树突生成和黑素转运的作用研究[D].复旦大学,2009.
[10]涂彩霞,张荣鑫,刘亚玲,等.18味中药乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响[J].中华皮肤科杂志,2006,39(7):400-402.
[11]李利,周敏,周光平,等.川芎嗪对正常人黑素细胞黑素合成的抑制作用[J].中国皮肤性病学杂志,2003,17(3):157-158.
[12]高桂华,徐华娥,李庆平,等.白藜芦醇对恶性黑色素瘤生长抑制作用的体外及体内研究[J].南京医科大学学・自然科学版,2009,6:790-793.
[13]罗增香,项蕾红,李剑,等.两味中药单体对人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影响[J].中国麻风皮肤病杂志,2008,24(8):583-585.
[14]HalabanR,LangdonR,Birchalln,etal.Basicfibroblastgrowthfactorfromhumankeratinocytesisanaturalmitogenformelanocytes[J].JCellBiolog,1988,107(4):1611.
[15]马慧军,田燕,刘雯,等.人表皮黑素细胞与HaCat细胞共培养体外模型的建立[J].中国美容医学,2009,18(2):188-190.
[16]仲少敏,吴艳,赵俊郁,等.中药抑制黑素生成作用的筛选研究[J].中国美容医学,2006,15(6):703-706.
[17]兰海龙,王正辉,杨壮群,等.芦荟苦素对黑素细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响[J].中国美容医学,2007,16(3):310-313.
[18]YoontJ,LeitC,YamaguchiY,etal.Reconstituted3-dimensionalhumanskinofvariousethnicoriginsasaninvitromodelforstudiesofpigmentation[J].analyticalbiochemistry,2003,318(2):260-269.
[19]LeeJH,KimJe,KimBJ,etal.invitrophototoxicitytestusingartificialskinwithmelanocytes[J].photodermatology,photoimmunology&photomedicine,2007,23(2-3):73-80.
[20]Damouro,augustinC,BlackaF,etal.applicationsofreconstructedskinmodelsinpharmaco-toxicologicaltrials[J].medicalandBiologicalengineeringandComputing,1998,36(6):825-832.
[21]杨颖,于淑贤,贾继章,等.利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究[J].中国修复重建外科杂志,2003,17(4):339-342.
[22]胡葵葵,戴育成,袁敬东,等.利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究[J].江西医学院学报,2005,45(6):28-31.
[23]杨壮群,王正辉,屠军波,等.体外构建色素化皮肤类似物模型[J].南方医科大学学报,2007,27(11):1670-1673.
[24]曹玉萍,周武庆,马鹏程,等.用HaCat细胞和正常人黑素细胞构建组织工程皮肤[J].毒理学杂志,2009,5:341-344.
[25]张铁良,屠军波,杨壮群,等.以鼠尾胶原为支架的真皮类似物的建立[J].中国美容医学,2006,15(2):131-133.
[26]刘源,金岩,王新文,等.构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究[J].中国修复重建外科杂志,2003,17(6):501-503.
[27]常艳,魏伟.细胞共培养及其应用的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2009,14(7):827-832.
细胞生物学研究方向篇8
1口腔肿瘤术后下颌骨缺损及其并发症
1.1口腔肿瘤术后下颌骨缺损
口腔颌面部具有一个丰富的淋巴系统，口腔癌一般都有下颌骨骨膜的侵犯。Sudhir对22例口腔癌是否侵犯下颌骨进行研究，分别用X线、Ct检查，发现有21例均有下颌骨的侵犯，并且与术后组织学相对照，其阳性率是一致的［2］。tsuchimochi等用99mtc?mDp骨扫描显示肿瘤引起了下颌骨松质骨的侵犯［3］。因此从肿瘤外科原则出发，必须作下颌骨切除，势必会引起下颌骨的缺损。
1.2下颌骨缺损的并发症
下颌骨缺损不仅仅影响面部美容，更重要的是可以引起如言语、吞咽、呼吸等功能的障碍。mcConnel等对下颌骨切除后的病人进行口咽吞咽效率(opSe)的检测，发现平均的opSe值明显低于正常值，30个病例中有8例不能进食，其余只能进点流质［4］。Haribhakti也证实了下颌骨缺损可引起呼吸困难、睡眠质量差、下齿槽神经损伤的各种并发症，使患者的生活质量大大降低［5］。
2组织工程学骨再造的主要研究进展
组织工程学(tissueengineering)是生物医学工程中的一个新的分支，是应用生命科学工程学的原理与技术，设计、构造、改良、培育和保养活组织，以修复或重建组织器官的结构，维持或改善组织器官功能的一门新兴的边缘学科。其基本方法是将体外扩增的正常组织细胞，吸附到一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，然后植入机体缺损部位，细胞在生物材料逐渐降解吸收过程中形成新的组织，达到修复缺损，重建功能的目的。Vacanti［6］等运用组织工程技术在裸鼠身上再生软骨，国外已有较多的关于软骨组织的组织工程［7］；国内曹谊林教授首次采用组织工程技术在裸鼠体内再生了带血管的骨组织，并用于修复骨缺损，为骨组织缺损的修复提供了一条新的思路和途径。
骨组织的再生要求有三个基本的生物学因素参与，即细胞、生长和分化因子、细胞外基质材料，这也是当今组织工程研究中的三大课题。源细胞经过培养可以分化成成骨细胞；生长分化诱导因子可以促进成骨细胞的分化增殖，保持成骨细胞不衰老；生物可降解材料可作为细胞支架，支持细胞的附着、迁移和分化［8］。
2.1种子细胞(成骨细胞)
2.1.1来源的选择
理想的骨组织工程学种子细胞应具备下列特点：(1)取材容易，对机体损伤小；(2)在体外培养中易定向分化为成骨细胞和具有较强的传代繁殖力；(3)植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性，有以下四种来源［9］。
2.1.1.1胚胎骨：
目前较多使用的是胚胎或新生动物骨或人胚胎骨。由骨分离出的细胞主要含有4种成分：骨内膜细胞、骨外膜细胞、骨细胞、未分化的间充质细胞。在体外培养中表现为两种形态：可贴壁的成纤维细胞样细胞和不贴壁的圆球型细胞。利用骨作为来源获得的细胞在体外较易定向分化为成骨细胞，且具有生长迅速，传代繁殖快的优点。但此法会对患者造成手术损伤且供源有限。
2.1.1.2骨外膜：
骨外膜分为内外两层。其中内层含有较多的骨原细胞和成骨细胞。已有较多的研究证实［10］来源于骨膜的细胞具有很强的传代繁殖和定向分化成骨细胞的能力，植入机体后能适应受区的环境，保持成骨活性，并最终通过软骨成骨而修复骨缺损，是目前广泛应用的成骨细胞来源。
2.1.1.3骨髓：
骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质，骨髓基质细胞称作成纤维细胞集落形成单位，它具有多向分化潜能。骨髓具有取材方便、对供体损伤小、有流动性和可经皮注射等优点，具有广阔的发展前景。
2.1.1.4骨外组织：
骨外组织如表皮细胞、成纤维细胞，这些起源于胚胎时期间充质的骨外部位的骨祖细胞称作诱导性祖细胞(iopC)。此法取材容易，对人体的创伤较小，体外培养传代繁殖力较强，提供了一条新的成骨细胞来源。
2.1.2成骨细胞与生物降解聚合物的体外培养
attawia［11］等将成骨细胞种植在聚羟乙酸支架上，并在含10%胎牛血清的培养液中培养。7～10天后，成骨细胞粘附到聚合物支架上，并发生增殖，培养液中有钙化骨形成。Cooper［12］也进行了类似的研究，将成骨细胞分别种植到pma、CpH、pma/CpH共聚物上，2周的体外培养期间，成骨细胞发生了粘附、增殖，表达了较高的碱性磷酸酶活性，并有胶原合成。这些研究说明：种植到支架上的成骨细胞在合适的营养环境中，能与聚合物很好地结合，并保持其增殖和成骨功能。
2.1.3成骨细胞形成骨组织的最佳细胞浓度
种子细胞的选择是组织工程修复缺损的关键步骤。适当的种子细胞浓度既可以直接修复缺损，又可以通过分泌细胞生长因子，促进间充质未分化细胞向种子细胞转化，加速愈合［13］。浓度过低，基质和细胞因子分泌不足，将限制细胞的生长。浓度过高，细胞之间将过早发生接触抑制，在取材上也有困难。夏万尧、曹谊林等的实验选择浓度从10×106/ml～70×106/ml的细胞进行研究，并作He、Safranin染色观察，结果确定接种细胞浓度为50×106/ml时形成的软骨组织最佳［4］。至于骨组织形成的最佳细胞浓度尚有待进一步研究和探索。
2.1.4成骨细胞与环境的关系
2.1.4.1成骨细胞与细胞基质(eCm)的关系：
成骨细胞的eCm包括无机和有机两部分，无机盐以羟基磷在石形式存在，主要作用为增强骨组织的力学强度；有机成分以Ⅰ型胶原为主，还包括骨钙素，骨桥蛋白，骨连接蛋白，纤维连接蛋白，层粘连蛋白等无定形基质。目前认为有机成分在成骨细胞增殖、分化过程中发挥重要作用。nolan［15］等证实成骨细胞在脱钙骨基质上有很强的粘附和增殖能力。其中Ⅰ型胶原可刺激多潜能间充质细胞向成骨细胞方向转化，并促进成骨细胞表达碱性磷酸酶。
2.1.4.2成骨细胞与物理力的关系：
把细胞?基质结合物放入铸模里，使它们承受减切力、张力和其他一些在生长过程中受到的已知力，这也是设计和组织工程所需要的。施加物理力是形成和推动基因活动的重要因素，研究证实机械应力可促进成骨细胞表达β1intergrin,从而增加成骨量［16］。
2.1.4.3成骨细胞与血管内皮细胞的关系：在骨的改建过程中，成骨和血管化是密切相关的。血管内皮细胞可合成和分泌一系列可溶性的调节介质，包括生长因子和细胞因子，这些因子具有控制成骨细胞增殖、分化等作用；另一方面，wang［17］等证实成骨细胞能分泌血管内皮细胞生长因子(VeGF)、FGF等促血管形成因子，作用于内皮细胞，促进血管形成。
2.2生物可降解材料
生物可降解材料又称为细胞外支架材料，理想的材料应具备下列条件：(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性，材料可最终被受植床组织完全替代；(3)易加工成型，并具一定的强度，抑制后能保持原状；(4)材料表面易于细胞粘附且不影响其增殖分化。
组织工程中应用的材料有天然材料和人工合成的高分子聚合物材料。天然材料如胶原、脱矿骨等；目前最受人青睐的材料是一些合成的生物降解聚合物如聚乳酸(pLa)、聚乙醇酸(pGa)和pLa/pGa共聚物。pLa和pGa具有良好的生物相容性和生物降解性，其代谢产物可通过代谢途径或经肾脏排出体外。学者们对这类材料研究取得了较大的进展，如whang等［18］采用层压技术将聚合物制成三维立体多孔结构，其孔隙率达90%，孔的平均大小在16～32microm，组织形态学观察其成骨量要明显高于对照组，这样的微孔结构给种植细胞提供了较大的粘附面并有利于粘附的细胞与周围环境交换营养、气体和废物排泄。
最近有学者用脱乙酰的甲壳质(chitosan)和磷酸三钙(tCp)复合的海绵球作为成骨细胞培养的基质，发现该材料促进了成骨细胞的增殖和分化，有较高的碱性磷酸酶的表达及矿物化；光镜和电镜显示成骨细胞很好地附着在海绵球表面，并在14天时看到骨样物质的沉积［19］。
2.3生长调节因子
生长调节因子主要是生长因子和细胞因子。在组织工程中，某些种子细胞在体外传代培养后，经过一段时间后，细胞极易衰老，而生长因子能调节骨种子细胞的增殖和分化。对成骨细胞起着重要调节作用的生长因子有转化生长因子?β(tGF?β)，胰岛素样生长因子(iGF)，骨形态发生蛋白(Bmp)，碱性成纤维细胞生长因子(b?FGF)，血小板衍生生长因子(pDGF)等。
成骨细胞本身可合成分泌tGF?β，细胞膜上有tGF?β的特异性受体，tGF?β作用于体外培养的成骨细胞，抑制其Dna的合成和aKp活性，促进胶原蛋白和非胶原蛋白的合成［20］。b?FGF起着形态发生因子和促有丝分裂作用，刺激骨细胞的Dna合成，减弱oC、aKp的mRna表达。pDGF可促进成骨细胞增殖，但对胶原合成无影响。Bmp可诱导血管周围间充质细胞不可逆地向成骨细胞系方向转化，提高成骨细胞的aKp活性。iGF在骨组织中含量较高，约(1mg/kg)，可刺激成骨细胞增殖，促进胶原蛋白的合成。
Strayhorn［21］等采用鼠成骨前细胞株mC3t3?e1和northern杂交分析法研究了各类生长因子对成骨细胞增殖及相关基因的表达，显示单用pDGF抑制iGFmRna的表达，阻断了骨钙素基因的表达，而单用iGF及Bmp增加相关基因的表达。研究同时发现pDGF/iGF合用明显增强增殖分化相关基因的mRna表达，促进了骨的形成。由此可见，生长因子之间的协同或拮抗作用还是很明显的，单一生长因子的作用或其浓度和剂量的改变是否会影响成骨细胞的增殖分化尚待进一步研究。
2.4临床前试验研究
临床前试验也即动物实验，其目的在于了解成骨细胞在体内的生长代谢、成骨情况以及生物材料的特性。
2.4.1成骨细胞—生物降解材料复合物移植于皮下的成骨作用
Levy［22］等在体外培养研究的基础上，将成骨细胞—pGa复合体移植到裸鼠背部皮下观察其成骨情况。植入后6周观察有软骨形成，在侵入的血管周围有新生的骨组织；20周时，可见大块骨组织形成。由此可见，成骨细胞—生物材料植入体内后先形成软骨，然后经历血管侵入和形态发生而形成骨组织。
2.4.2成骨细胞—生物降解材料复合物移植修复缺损
Lewandrowski［23］等用种植有成骨细胞聚合物修复骨缺损，以单纯聚合物植入作对照，发现实验组在术后1周即出现编织骨组织形成，至第4周时，新生骨组织渐趋成熟，至第8周时，缺损完全为骨组织充填，生物材料已完全降解吸收，未见免疫细胞浸润，Safrainin0染色阳性。
用带血管蒂的骨修复骨质缺损有很多优点，但这种移植材料取材极有限，能否利用组织工程技术来制造这种带蒂的骨修复材料又是当今的一大热点。已有学者［24］从胎牛肱骨骨膜分离的成骨细胞种植到聚合物支架上，体外培养2周后，将成骨细胞—聚合物复合体移植到无胸腺大鼠的右股血管周围，术后9周形成了新生的骨组织，最终形成了带血管蒂的小梁骨。
3组织工程学在颌骨缺损修复中的应用
下颌骨缺损的修复(尤其是肿瘤性的)一直是口腔颌面外科的难题，研究合适的骨缺损修复材料显得尤为必要。Henning［25］等在制作小猪下颌骨缺损模型的基础上，把聚乳酸和成骨细胞的复合物植入缺损区，再加上b?FGF，采用三维模式观察骨组织的生长情况。结果发现新生骨组织均可在此支架上附着，并提出了较适宜的b?FGF浓度为8μg/ml。组织工程骨再造在颌骨缺损修复的临床前试验有待进一步研究。
4组织工程骨再造的应用前景和存在问题
以细胞和生物降解聚合物复合移植来恢复、保持和改善组织功能为特征的组织工程学技术为骨的修复提供了新的方法［26］，与其他骨修复方法相比具有以下优点：(1)需要的供体组织少(细胞可在体外培养、增殖)；(2)可根据修复缺损的需要将植入物制成精确的三维形状。我们可以通过成骨细胞与生物降解材料的混合培养、骨的塑形及动物实验来进行特定形态骨再造的研究，以此可以修复大量的肿瘤性骨缺损的病例，其应用前景是光明的，但仍存在下列问题：(1)现有的合成性生物降解聚合物强度不足，受力时易变形，这样会损伤移植的细胞，材料性能有待进一步研究；(2)种子细胞的衰老问题，尚需进一步研究生长因子对成骨细胞的作用；(3)对于特殊解剖形态的颌骨部位，如何将细胞—生物材料复合体固定到骨缺损区也是一个重要问题。
参考文献
1.徐光炜.肿瘤外科历史回顾及未来憧憬.国外医学肿瘤学分册，2000；27(1)：1-2
2.SudhirBahadur.mandibularinvolvementinoralcancer.theJournalofLaryngologyandotology,1990;104(12):968-971
3.tsuchimochim,Katagirim,maedaK,etal.autoradiographicevaluationof99m?tc?methylenediphosphonateaccumulationinoralcancerinvadingthemandible.JoralmaxillofacSurg,1999;57(3):245-254
4.mcConnelFm,LogemannJa,Rademakeraw,etal.Surgicalvariablesaffectingpostoperativeswallowingefficiencyinoralcancerpatients:apilotstudy.Laryngoscope,1994;104(1ptl):87-90
5.HaribkaktiVV.thedentatehumanmandible:ananatomicbasisforsurgicaldecisionmaking.plastReconstrSurg,1996;97(3):536-541
6.VacantiJp,LangerR.Synthenicpolymersseededwithchondrocytesprovidedatemplatefornewcartilageformation.plastReconstrSurg,1991;88(5):753
7.wakitaniS,Gotot,YoungRG,etal.Repairoflargefull?thicknessarticularcartilagedefectswithallograftarticularchondrocytesembededinacollagengel.tissueeng,1998;4(4):429-444
8.BruderSp,FoxBS,tissueengineeringofbone.Cellbasedstrategies.Clinorthop,1999;(367Supple):S68-83
9.魏宽海综述.组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择.国外医学创伤与外科基本问题分册，1998；19(3)：155-157
10.malekzadenR,HollingerJo,BuckD,etal.isolationofhumanosteoblast?likecellsandinvitroamplificationfortissueengineering.Jperiodontol,1998;69(11):1256-1262
11.attawiama,HerberKm,UhrichKe,etal.proliferation,morphology,andproteinexpressionbyosteoblastsculturedonpoly(anhydride?co?imides).JBiomedmaterReS,1999;48(3):322-327
12.CooperLF,masudat,YliheikkilapK,etal.Generalizationsregardingtheprocessandphenomenonofosseointegration.partⅡ.invitrostudies.intJoralmaxillofacimplants,1998;13(2):163-174
13.VunjaknG,obradovicB,martini.Dynamiccellseedingofpolymerscaffoldsforcartilagetussueengineering.Biotechnolprog,1998;14(2):192
14.夏万尧，曹谊林，商庆新等.组织工程化软骨组织形成的最佳细胞浓度和最佳形成时间的实验研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(4)：244-248
15.nolanpC,nicholasRm,mulhollandBJ,etal.Cultureofhumanosteoblastondemineralizedhumanbone.JBoneJoint(Br),1992;74(2):284
16.CarvalRS,YeneH,ScottJe.theeffectsofmechanicalstimulationonthedistributionofbetalintehrinandexpressionofbeta?1integrinmRnainte?85humanosteosarcomacells.archoralBiol,1995;40(3):257
17.wangDS,YamazakiK.increaseofvascularendothelialgrowthfactormRnaexpressionby1,25?dihydroxyvitaminD3inhumanosteoblasts.JBoneminerRes,1996;11(4):472
18.whangK,HealyKe,elenzDR,etal.engineeringboneregenerationwithbioabsorbablescaffoldswithnovelmicroarchitecuture.tissueengineering,1999;5910:35-51
19.LeeYm,parkYJ,LeeSJ,etal.tissueengineeredboneformationusingchitosan/tricalciumphosphatesponges.Jperiodontol,2000;71(3):410-417
20.BlomeJ,Klein?nulendJ,KleinCp,etal.transforminggrowthfactor?betalincorporatedduringsettingincalciumphosphatecementstimulatesbonecelldifferentiationinvitro.JBiomedmaterRes,2000;5(1):67-74
21.StrayhornCL,GarrettJS,DunnRL,etal.Growthfactorsregulateexpressionofosteoblast?associatedgenes.Jperiodontol,1999;70(11):1345-1354
22.LevyFe,HollingerJe,SzachowiczeH.effectofabioresorbablefilmonregenerationofcranialbone.plastReconstrSurg,1994,93:307
23.LewandrowskiKU,CartaneomV,GresserJD,etal.effectofapoly(propylenefumarate)foamingcementonthehealingofbonedefects.tissueengineering,1999;5(4):305-316
24.GrayC.advancedboneformationingroovesinvitroisnotrestrictedtocalcifiedbiologicalmaterials.tissueengineering,1998;4(3):315-323
细胞生物学研究方向篇9
1.1在蛋白质分析中的应用QDs最初用于生物领域是应用于简单的生物大分子,链接方法是将QDs通过带有氨基或羧基的试剂修饰,调节溶液环境,通过QDs表面的功能基团和生物分子上的氨基或羧基实现共价偶联或静电作用等来完成QDs与生物大分子(蛋白质、核酸、生物酶等)的链接,目前这一领域的应用仍然非常活跃。nie[9]等人将QDs用于非同位素标记的生物分子的超灵敏检测,使巯基乙酸处理过的ZnS包裹的CdSeQDs通过酰胺键与转铁蛋白结合,进而能被细胞膜上的受体离子通道识别,进入细胞内部,在结合或传输过程中没有明显的干扰作用。这表明利用这种方法可以研究活细胞中供体/受体之间的反应或分子交换。Goldman等[10]曾将QDs与抗体结合,成功地对葡萄球菌肠毒素和2,4,6-三硝基甲苯进行了荧光免疫分析。Ghazani等[11]将组织微阵列技术、光谱分析技术与QDs相结合,发展了一种用于定量测定肿瘤中蛋白质表达的新方法。mahtab等[12]将具有特定结构的核酸序列吸附于QDsCdS上,QDs表面敏化发光行为则能区分“直线型”、“弯曲型”和“扭结型”的双链寡核苷酸,在探测核酸结构的方法上有了创新。Koji等[13]构建了一种更新颖、快捷的蛋白质记录材料可根据光连接器提供的信息调整记录、阅读荧光蛋白的排列,清晰地读出蛋白质配体复合物的组成,该技术对生物芯片的微型排列具有重要的意义。
1.2在Dna分子研究中的应用QDs经过恰当的修饰可以与Dna分子进行连接。ebenstein等[5]采用单QDs识别Dna结合蛋白。先将Dna与Dna结合蛋白交联,然后用偶联逆转录因子抗体的4种不同颜色的QDs标记上述交联复合物,经过一系列处理最后在单一光源的激发下,QDs于605nm、625nm、655nm及705nm发出绿、红、黄、白4种不同的颜色,通过荧光显微技术来分析判断蛋白质的位置从而能够确定Dna分子上的多个蛋白质的位置。Han等[14]利用不同颜色的QDs标记多色编码微珠与遗传物质条带连接,用于Dna杂交检测,在Dna的测序方面取得了突破性进展。Qi等[15]采用amphipol修饰QDs,amphipol具有交错的亲水性和疏水性侧链,可携带siRna进入细胞质并保护siRna防止其被酶解,实现了实时监测QDs-siRna在细胞中的进出、内吞小体的逃逸、运输、传递过程,而这种多功能QDs的出现,也促进了实用基因组学和基因治疗学的研究。
1.3在活细胞及活体组织成像中的应用QDs荧光探针在多光子显微镜技术中的应用,使其在活组织中的多色成像成为可能。最早Dubertret等[16]将QDs胶囊注入非洲蟾蜍胚胎中观察其胚胎发育过程,发现胶囊QDs在生物体内很稳定,且毒性很低,不影响细胞生长和发育,也不易发生光漂白,是对QDs荧光探针用于活体组织的成功探索。Gao等[17]将QDs包于peG-pLa中,连接麦胚芽凝集素(wGa-QDs-np)后注入鼻腔,QDs经嗅觉黏膜组织进入大脑皮层细胞标记了大脑组织中的病变部位,促进了对中枢神经系统疾病的诊断和治疗方面的研究。Yum等[6]用纳米针将荧光QDs通过机械化学的方法渗透细胞膜进入活细胞的细胞质和细胞核,这较传统方法有了重大突破。Zhang等[18]利用CdHgteQDs在近红外区针对裸鼠进行了荧光成像。结果显示近红外QDs荧光标记物具有更强穿透力、更易激发且检测灵敏度更高等优点,故可进行更长时间的生物体外和活体的实时跟踪和荧光检测,这标志着QDs作为新兴荧光标记物在活细胞生命动态过程示踪研究中将发挥极为重要的作用。
1.4在激素及生物因子研究中的应用QDs不仅可以在细胞水平及动物活体中应用,在细胞亚结构中甚至在激素和生物因子水平也有报道。matsu-no[19]利用QDs的特性和激光共聚焦扫描显微镜对生长激素和泌乳刺激素及它们的mRna进行了三维成像。Lidke等[20]将QDs标记到表皮生长因子上,通过激光共聚焦显微镜,观测到肿瘤细胞通过胞吞途径特异性摄取这种表皮生长因子的全过程。这些成果将为生长发育学和内分泌学的研究打开了一个新窗口。
1.5在肿瘤等疾病研究中的应用近年来QDs在细胞生物研究应用领域得到进一步拓宽,将QDs荧光探针用于肿瘤等疾病的研究具有突破性意义。早期Bawendi等[21]就提出利用近红外荧光QDs进行动物体内前哨淋巴结活组织检查的方法。他们将近红外QDs用多配位基配体包覆后注入动物体内进行整体成像发现,通过QDs标记,医生可看清lcm深组织下的前哨淋巴结,且可准确地指导手术进行,确保前哨淋巴结的完全切除。与传统的外科手术相比,前哨淋巴结的活组织检查可减少手术创伤,且检查结果更为准确。Yu等[22]用能靶向于肝细胞癌的甲胎蛋白抗体键合QDs作为荧光探针,通过整体的荧光成像系统对肝癌细胞进行成像来检测活体内的肝癌细胞。tada等[23]采用背部皮肤固定器和高灵敏CCD高速共聚焦显微镜观察乳腺癌细胞特异性探针在老鼠体内的运动情况,这种高灵敏可视化示踪为癌症研究提供了新方法。Jiang等[24]将连接聚乙烯亚胺和透明质酸的QDs(pei-HaQDs)注入B16F1细胞,结果显示在Ha受体介导下,pei-Ha表现出对小干扰Rna(siRna)特异的标识性能,而且pei-Ha-siRna主要积聚在肝脏、肾脏和肿瘤。Bhirde等[25]通过将带有抗癌药—顺铂的QDs和表皮生长因子(eGF)分别偶联在单壁碳纳米管两端而把抗癌药带入癌细胞,并通过QDs观察抗癌药对癌细胞的作用,为癌症的治疗开辟了新天地。
2QDs作为荧光探针目前面临的挑战
QDs荧光探针技术最大的挑战就是如何克服其细胞毒性。最近mahto等[26]对表面修饰的毒性进行了研究,发现不同修饰的QDs在细胞中的定位不同。共聚焦图像显示巯基乙胺mpa包裹的QDs主要分布在胞质区,而Ga/topo(对表面配位基进行修饰)包裹的QDs在细胞中却没有发现。入胞的mpa包裹的QDs有良好的细胞相容性,而胞外的Ga/topo包裹的QDs细胞毒性却很大。Li等[27]研究结果证实粒径大小对其毒性的影响,低于40μg/ml时,纳米级的CdSQDs毒性显着大于微米级的CdS。QDs的毒性机制仍需进一步研究,随着技术的发展,QDs的合成修饰有望走向“绿色化、低毒化”,为QDs更广泛的应用奠定基础。
细胞生物学研究方向篇10
侧脑室室管膜下区和齿状回的颗粒下区的神经祖细胞通过增殖和分化产生新生细胞的神经再生过程终生存在于哺乳动物脑内。本文综述了神经祖细胞增殖、迁移、分化并功能性整合的调节机制，并对病理条件下的神经再生以及脑内神经再生研究目前存在的问题和局限性作了进一步的讨论和分析，希望对神经系统疾病的替代治疗研究具有一定的启示作用。
【关键词】神经再生；神经干细胞；神经祖细胞；室管膜下区；齿状回颗粒下层
aBStRaCt:neurogenesisissustainedthroughoutadulthoodinthemammalianbrainduetotheproliferationanddifferentiationofadultneuralprogenitorcellsfoundinthesubventricularzoneofthelateralventriclesandsubgranularzoneofthedentategyrus.thisreviewcoversrecentfindingsthatelucidatedifferentaspectsofregulationofneurogenesis，includingproliferation，migrationanddifferentiationintomatureneuronsandfunctionalintegrationintotheexistingneuralcircuits.Furthermore，thisreviewalsodiscussestheeffectsofpathologicalconditionsonadultneurogenesisinbothrodentmodelsandhumanpatientsaswellassomeofthepotentialproblemsorlimitationsinneurogenesisresearch，whichmayshedsomelightondevelopingnovelresearchstrategiesforreplacementtreatmentofneurologicaldisorders.
KeYwoRDS:neurogenesis;neuralstemcell;neuralprogenitorcell;subventricularzone;subgranularzoneofthedentategyrus
在成年哺乳动物大脑内，每天都有成千上万个新神经元产生。这些新生神经元分别来自脑内两个狭小的区域：侧脑室的室管膜下区(subventricularzoneofthelateralventricles，SVZ)和海马齿状回颗粒下区(subgranularzoneofthedentategyrus，SGZ)(图1)。来自SVZ的新生神经细胞通过长距离的迁徙到达嗅球，成为那里的中间神经元；来自SGZ的细胞则到达临近的齿状回颗粒细胞层，成为那里的兴奋性神经元。上述现象在哺乳动物脑内终生存在，神经科学研究者称之为脑的神经再生(neurogenesis)，而这些寄居于SVZ和SGZ、具有一定增殖分化潜能的细胞就是脑内的神经祖细胞(neuralprogenitorcell，npS)。它们之所以没有被明确称为神经干细胞(neuralstemcells，nSCs)，是由于它们在体外培养时所具有的自我更新特征和可以分化为所有类型神经细胞，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力并没有从体内得以证实。因此，在这里我们用“神经祖细胞”来总体地描述脑内所有可分裂并具有一定分化能力的细胞。
那么，在大脑的其他区域是否也存在神经再生现象？研究者普遍认为，即使在大脑灰质、脑室的其他部位存在npS，但由于它们的增殖过于缓慢，也很难被观察到或者加以利用。研究已证实，在脑内广泛存在胶质祖细胞(glialprogenitors)，但这些细胞在体内并不能分化成为中枢神经系统最基本的功能单位--神经元[1]。
脑内存在可增殖细胞库和神经再生现象使科学家、甚至公众看到了新的希望：是否可以通过操纵内源性神经再生对许多疾病造成的神经组织损伤起到神经元替代和功能修复作用？为了实现这一目标，科学家们正在对脑内npS的生物学特征、神经再生的调控机制以及以此为基础的疾病治疗进行夜以继日的研究，并取得了初步进展。
1脑内npS的生存微环境和生物学特征
研究者认为，微环境因素可能为npS的增殖、分化、存活、迁移并进行功能整合提供保障，这种微环境被称作为“神经发生微环境(neurogenicniche)”。在SVZ周围，室管膜细胞表达noggin蛋白可以通过阻断骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins，Bmps)信号途径促进SVZ的神经再生[2]，室管膜细胞还可能通过色素上皮源性因子(pigmentepitheliumderivedfactor)促进SVZ的npS自我更新[3]。另外，多巴胺能神经末梢也紧临SVZ的npS，它们可能通过D2样多巴胺受体促进npS的增殖[4]。SGZ的npS紧邻致密的齿状回颗粒层，周围成熟和新生神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和齿状回门区(hilus)的GaBa能中间神经元共同参与SGZ的npS微环境构成。有研究表明，星形胶质细胞可能通过wnt信号途径调节SGZ的神经再生[5]。另外，脑内npS的增殖和周围的微血管环境紧密相关，从脑内微血管释放出的一些因子可能直接作用于npS。
啮齿动物脑内的npS表达nestin、GFap、GLaSt和Sox2等标记物，但这些标记物并非npS所独有。表达这些标记物的细胞是否一定就是npS，目前尚不能完全确定。
SVZ存在有3种类型的npS。B型为GFap阳性的npS，C型为运输扩增细胞，a型为迁移成神经细胞。其中B型细胞处于相对静止的状态。区分3种类型的细胞主要依靠电镜下的形态学分析，C型和a型细胞还可以通过BrdU、DCX和聚唾液酸神经细胞粘附分子(polysialicacidcontainingneuralcelladhesionmolecule，pSanCam)等特异性标记物标记来区分。SVZ的npS分化潜能是有限的，其后代的命运已经被从神经系统早期发育阶段所得到的生物信息所决定[6]。在正常啮齿动物的大脑，SVZ的细胞与沿着局部血管延伸的基膜相互作用，新生细胞通过RmS(rostralmigratorystream)链式迁移路径到达嗅球，并开始放射状的向颗粒细胞层和球旁细胞层迁移[7]。经历形态和功能演变的新生神经元形成功能性GaBa受体并最终整合为颗粒神经元和球旁神经元。整个过程大约需要数周时间去完成。这种链式迁移形成一个延伸的细胞聚集带，并被星形胶质细胞所包绕。虽然这些星形胶质细胞在细胞的迁移中并不起关键作用，但它们可能通过调节GaBa的水平而影响细胞迁移速度。SVZ三型npS的功能意义仍不清楚，一些研究者认为它们似乎只是处于不同分化阶段的npS。
根据形态学和表达的生物标记物不同，SGZ的npS分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型海马npS具有长的放射状的突起跨越颗粒细胞层，到达齿状回分子内层，这些细胞表达nestin、GFap和SRY蛋白相关的含HmGbox的转录因子Sox2等。Ⅱ型海马祖细胞的突起很短，而且不表达GFap。SUH等[8]新近的研究表明，表达Sox2的海马npS具有自我更新能力，不仅可以分化成为神经元，还可以分化成星形胶质细胞。首次表明海马的npS具有nSCs的特征。SGZ的新生细胞通过短距离的迁移达到齿状回的颗粒细胞层。新生的颗粒细胞在GaBa的作用下发生去极化和超级化，这对于它们的成熟至关重要。新生细胞在2周时与门区的细胞和Ca3区的锥体细胞开始形成突触，在2～4周时开始长出树突棘。大约在第4周，新生细胞已经展现出了成熟颗粒细胞的特征，但实际上，它们的形态和功能变化仍在继续。新生颗粒细胞一旦成熟，它们就像齿状回的其他神经元一样开始接受谷氨酸能和GaBa能神经元的投射[910]。
很多新生神经元在它们产生后的4周内死亡。有多种机制参与调节这些新生细胞的存活。事实上，新生神经元是否能够生存和整合，在它们产生后的1～3周内已经被大致确定。因此，有研究者认为，海马新生未成熟神经元和不同形式的学习记忆形成有关。总之，脑内神经再生是经过细胞增殖、早期分化、存活、迁移、终末分化和功能整合等一系列事件，而完成由npS成为脑局部成熟神经元的过程(图2)。
2脑内神经再生的调控
脑内神经再生的调控是一个包括细胞外因素和细胞内机制的复杂过程，它是神经再生研究的热点和难点。
2.1细胞增殖的调节
2.1.1生长因子
表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，eGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor2，FGF2)可以强有力地促进体外培养nSCs的增殖。在体内，eGF和FGF2也可以促进SVZ和SGZ的细胞增殖并维持脑内的可增殖细胞库。不仅外源性生长因子有这样的作用，内源性eGF和FGF2对于体外培养和体内nSCs/npC增殖也是非常重要的[11]。事实上，eGF受体主要表达于介于nSCs和神经前体细胞之间的npS。转化生长因子α(transforminggrowthfactorα，tGFα)通过SHH(sonichedgehog)信号途径调节成体脑的神经再生[1213]。另外，脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor，BDnF)[14]、胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactor1，iGF1)[15]等都是调节脑内细胞增殖的重要因素。
这些生长因子除了可能直接作用于npS外，也可能作用于其他类型细胞，通过改变npS的微环境而调节神经再生。学习、锻炼和环境改善对神经再生的促进作用就可能是通过对上述生长因子的调节而实现的。另外，FGF2和tGFα都产生于星形胶质细胞，提示通过胶质细胞途径可能会找到调节它们的途径。
2.1.2神经递质
脑内神经递质已被明确证实参与脑内的神经再生。内源性5羟色胺(5hydroxytryptamine，5Ht)可以促进SVZ和SGZ的神经再生[16]。研究表明，上述作用部分是由5Ht1a受体所介导的[17]，刺激BDnF的表达也是其作用机制之一[18]。另外，5Ht能神经在SVZ的带状神经支配可能参与建立npS的微环境。新近的研究表明，黑质纹状体的多巴胺能系统主要通过其D2受体家族促进SVZ的神经再生[4，19]。还有研究表明，激活D3受体家族也促进了SVZ的神经再生[20]，但这种作用具有种属特异性。从蓝斑向齿状回投射的去甲肾上腺素能神经纤维参与调节海马的神经再生[21]。来自于基底前脑的乙酰胆碱可能通过β2烟碱受体促进齿状回的细胞增殖[2223]，SVZ和临近的纹状体内已经被证实存在高水平的乙酰胆碱，提示乙酰胆碱也可能在SVZ的神经再生中发挥作用，但目前还没有直接证据加以证实。
截至目前，形态学研究没有发现nmDa受体nR1亚基在脑内增殖细胞中的表达，而且，海马的npS是否表达功能性的nmDa受体也未明确。但海马的细胞增殖却与脑内整体的nmDa受体依赖活动紧密相关。也有研究表明，nmDa受体可以改变脑内神经再生[2425]。GaBa可以直接去极化海马Ⅱ型npS而增加Ca2+内流和神经分化因子neuroD的表达，提示GaBa能神经元的投射可能促进海马Ⅱ型npS的分化[26]。
我们发现，体外培养的胚胎大鼠神经干细胞表达代谢型谷氨酸受体(metabotropicglutamatereceptors，mGluRs)的一些亚型，它们是mGluR3、mGluR4、mGluR5、mGluR6和mGluR7，激活这些受体可以明显促进nSCs的增殖；激活mGluR7可以促进nSCs增殖和向神经元的分化，而且，这种作用可能是通过mapK途径实现的。
由于这些神经递质的受体在npS的表达还远未明确，因此它们是否直接作用于脑内的npS还不能确定。
2.1.3激素
激素及其分泌的昼夜节律在维持脑内细胞增殖中起到重要作用。iGF1促进SGZ细胞增殖的作用可能是通过雌激素介导的[27]；甲状腺素通过α受体促进成体脑内齿状回的细胞增殖[28]；催乳素和tGFα共同促进SVZ的细胞增殖和分化[29]。有研究表明，肾上腺皮质激素对于SGZ的神经再生有两方面的作用：绝对水平的糖皮质激素压制神经再生，而完整的激素分泌日夜节律对于糖皮质激素的下游调节子5Ht和no调节神经再生的作用则是必需的[3031]。
2.1.4神经细胞因子
细胞因子也会影响脑内的神经再生。睫状节神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor，CntF)通过诱导notch1促进培养神经前体细胞的增殖[32]。阻断CntF降低了SVZ的神经再生，表明它是一个内源性神经再生调节因子[33]。iL6在星形胶质细胞的过表达减少了npS的增殖[34]，这可能是炎症降低神经再生的原因之一。另外，白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor)也可以促进嗅球的神经再生[35]。
2.2细胞单向迁移的调节
SVZ的新生细胞沿着RmS路径向嗅球迁移，以及SGZ的新生细胞短距离向齿状回颗粒细胞层的迁移是一系列可扩散的化学趋化物、排斥物和局部引导分子协同作用的结果[3639]。趋化因子(chemokines)在定向迁移中起重要的趋化作用，SDF1和其受体CXCR4是参与其中的重要分子。嗅球释放趋化因子prokineticin2来引导RmS路径上的成神经细胞[40]。相反，在迁移细胞的尾部，由隔核和脉络丛分泌的神经迁移导向因子slit蛋白则起到排斥的作用[4142]。
在细胞的迁移过程中，保持迁移细胞粘聚在狭窄的迁移路径无疑是重要的。由围绕RmS的胶质细胞管表达分泌的粘蛋白tenascinC的排斥作用可以使迁移的新生细胞聚集在一起[43]。除此之外，还有一些分子也可能参与迁移细胞之间的粘附。有研究表明，eph/ephrin信号途径在维持迁移链的粘聚中起作用[44]。
细胞外基质在引导细胞迁移中起到关键作用。α6β1整联蛋白和与整联蛋白结合的细胞外基质蛋白，如层粘连蛋白(laminins)，便是发挥这种引导作用的重要分子[4547]。表达于RmS和周边的neu基因调节剂neuregulins可能通过erbB4促进成神经细胞的粘附性迁移并引导迁移细胞达到嗅球的颗粒细胞层和球旁细胞层[48]。另外，RmS链式迁移也依赖于迁移细胞表达的pSanCam[4951]。
在RmS的终点，迁移细胞就会呈辐射状地到达最终目的地。这一过程是由颗粒细胞和嗅球的内丛状层分泌的粘蛋白tenascinR[52]以及僧帽层分泌的reelin[53]所调节的。tenascinR、reelin和促红细胞生成素(erythropoietin)等也在引导迁移细胞转向需要细胞替代的区域中起作用。
2.3细胞分化和整合的调节
虽然新生神经元可以整合到局部神经网络并成为功能性神经元，但目前对于调节新生细胞表型分化的机制还远未明确。比如，到达嗅球的迁移细胞分化成为GaBa能和多巴胺能神经元的比例为9∶1，导致这种差异的原因目前并不清楚。
在体外，BDnF促进胚胎或神经前体细胞向GaBa能神经元分化[54]。研究表明，在SVZ联合应用骨形态发生蛋白抑制剂noggin和BDnF导致在新纹状体形成新的GaBa能神经元并发出轴突投射到临近的苍白球[55]。
维甲酸(retinoicacid)诱导新生细胞向神经元分化，并且和生长因子或低氧条件一起促进新生细胞分化成为多巴胺能神经元[5657]。有研究表明，RmS迁移路径中转录因子pax6可能参与细胞向多巴胺能神经元转化的调节机制[58]。
除了生长因子、神经营养因子、神经递质等介导的经典信号途径外，还有一些胞内机制被证实参与npS的行为调控[59]。例如核受体tLX、Bmi1等转录因子参与生后nSC的维护，转录因子pax6促进SVZ的npS分化。缺乏甲基化的CG序列结合蛋白1(methylCpGbindingprotein1，mBD1)可导致npS基因组稳定性的破坏和细胞分化的抑制。另外，和细胞周期调节、Dna修复以及染色体稳定有关的基因都参与成体脑内神经干细胞功能的维护和支持。
3神经再生和中枢神经系统疾病
脑内神经再生的生理意义尚未阐明。SVZ的神经再生在嗅觉的学习记忆中起到重要作用，SVZ神经再生的减少会导致气味辨别和气味记忆障碍，但二者之间直接的因果关系还有待确定[7，60]。虽然一些研究表明SGZ的神经再生在认知功能中的潜在作用，但也有一些研究得到了否定的结论[59]。
中枢神经系统的很多疾病都会影响SVZ和SGZ的神经再生，但其病理生理意义尚不清楚。癫痫发作可以加剧SGZ的神经再生[61]，新生细胞可以功能性地整合在海马的神经网络中，但却形成了病理性的联结[62]。一些抗癫痫药物可以抑制癫痫发作诱发的神经再生。
啮齿类动物局灶性或全脑缺血均可导致SVZ和SGZ的神经再生[63]。我们运用Dii标记室管膜/室下区细胞，采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化，发现局灶性脑缺血后，室管膜、室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞，脑缺血后SVZ附近nnoS的减少可能是促进神经细胞再生的机制之一[64]。我们还发现，npC在永久性脑缺血后沿胼胝体腹侧向缺血方向迁移，而且bFGF是其存活、增殖和分化的有效丝裂原[65]。
缺血损伤组织释放的各种因子有些是促进神经再生的，有些却对神经再生起到抑制作用，而且这些因子之间也相互作用。脑缺血损伤后新生细胞可以在血管的引导下到达缺血区的边缘并开始表达局部神经元的标记物。这种现象同样存在于中风患者。因此，脑缺血后对神经再生的刺激被认为是脑内的修复现象。但这些新生神经元能在局部存活多长时间，并在多大程度上整合入局部的神经网络还需要进一步的观察研究。
许多中枢神经退行性疾病也会影响脑内的神经再生。对于alzheimers病模型动物神经再生变化的研究结论尚不一致[66]。在过表达突触前神经末梢膜蛋白αsynuclein的parkinsons病模型动物，SVZ和SGZ细胞增殖虽然没有显著变化，但新生神经元的存活率却明显降低。alzheimers患者SGZ[66]、Huntingtons患者SVZ[67]的细胞增殖增加，而在parkinsons患者，SVZ和SGZ的细胞增殖却明显下降[68]。
炎症反应降低了脑内的神经再生[69]，这种现象也可以被抗炎药物所逆转。脑内反应性胶质细胞增生也阻碍脑内的神经再生。但也有研究表明，不同病理条件下的炎症反应对神经再生的影响也可能是不同的。中枢神经系统的其他疾病，如HiV感染[70]和药物成瘾[71]，也影响成体脑的神经再生。神经再生还和抑郁症有关。一些研究表明，抑郁症压制了SGZ的神经再生，SGZ神经再生的减少也会降低抗抑郁药物治疗的行为学效果[7273]。
上述疾病可以明显影响脑内神经再生以及疾病的病理改变和神经再生的明确相关性，清楚地表明，内源性神经再生具有修复脑病理损伤的潜能。目前，神经再生的调节理论已被逐渐应用于药理学研究，希望通过药物干涉促进疾病后的神经再生、进行损伤神经元的替代，并缓解疾病的症状。也有一些动物研究通过使用神经递质激动剂、生长因子等达到了部分症状缓解目的。我们在对很多相关中药进行的研究筛选后，发现川芎嗪可以显著促进大鼠脑缺血后SGZ、SVZ及皮层内神经干细胞增殖，研究结果还提示抑制nnoS的表达可能是其实现促神经细胞再生的作用的机制之一[7475]。
但就目前的研究进展而言，通过干涉神经再生而达到上述疾病的治疗目的还存在诸多问题：①通过药物刺激神经再生是否有利于疾病的恢复尚不能一概而论。比如癫痫后增加的海马神经再生有助于苔藓纤维芽发等病理性兴奋性神经环路的形成，从而加剧慢性癫痫病理基础的形成。②药物对疾病后神经再生促进作用的研究目前还处于动物模型水平，它们对人类疾病患者是否具有同样的作用还需要进一步的研究资料。③动物实验中，通过口服神经递质激动剂或者局部直接注射生长因子可以促进脑内神经再生，但人类大脑内细胞增殖率远低于啮齿类动物，因此药物干涉能否调集足够的新生神经元而达到替代修复的作用也是需要重视和研究的问题。④从理论上讲，通过刺激细胞增殖并应用化学趋化物可以引导新生细胞到达新纹状体等parkinson疾病相关脑区，但目前还不能控制这些新生细胞定向分化成为多巴胺能神经元。⑤人脑SVZ到豆状核、纹状体或缺血区的解剖距离较大鼠等啮齿类动物远得多，要使新生细胞定向迁移到这些脑区，需要在刺激细胞增殖的同时应用化学趋化物和引导物，这样的手段能否在患者的病理脑区产生足够的功能性神经元尚需大量的研究工作才能够证实。⑥调节因子的副作用和药代学问题。比如，虽然生长因子加强细胞增殖的效果很明确，但由于生长因子也可刺激错误的细胞，从而会出现身体其他部位的副作用。另外，绝大多数生长因子不能穿透血脑屏障，使药物的应用受到了很大限制。⑦尤其重要的是，药物刺激的神经再生能否使新生细胞在病灶局部达到功能性整合可能是目前及相当长的时间内需要解决的难题。
4脑内神经再生研究亟需解决的问题
过去几十年的研究已经使人们对成体神经再生有了较为深刻的认识。研究者已经确信神经再生现象存在于几乎所有的哺乳动物；认识到从细胞增殖到新生神经元的功能性整合的再生过程受到了复杂的细胞内机制和外源因素的调控和影响；初步表明了脑内神经再生的行为学功能和与中枢神经系统疾病的联系。