细胞生物治疗法篇1
美国奥西里斯治疗公司近日称，该公司研发的用于治疗儿童急性移植物抗宿主病（GVHD）的干细胞药物prochymal已被加拿大卫生部批准，成为全球首个被批准用于治疗全身性疾病的干细胞药物。
不止一种干细胞药物
如果以一个国家的卫生部或食品与药物管理局批准干细胞药物作为干细胞治疗的管理标准，prochymal可能并非第一个被正式批准的干细胞药物。因为，2011年6月，韩国食品药品管理局已正式批准，某专门从事干细胞药物研发的公司研发的心脏病干细胞治疗药物从2011年7月1日起投放市场销售。
不仅如此，2012年2月，韩国食品药品管理局表示，将考虑批准本国的第二种和第三种干细胞治疗药物的生产许可证，它们分别是，软骨再生治疗药物Cartistem和肛瘘干细胞治疗药物Cuepistem。Cartistem不是使用患者本人的干细胞，而是利用他人的干细胞制成的药物，因此，如果获得生产许可证，将会成为全球首例利用他人干细胞生产的治疗药物。该药的最大优点是可以批量生产。
因此，从干细胞药物这一概念来看，奥西里斯治疗公司的prochymal并非是第一种经国家医药卫生主管部门批准的干细胞药物，但是，它可能是第一个被国家医药卫生主管部门批准的治疗全身性疾病的干细胞药物。
如今，在经过国家卫生部门正式批准的干细胞疗法中，药物是较少见的，反而是干细胞治疗技术较多。例如，美国食品与药物管理局批准的组织工程软骨移植疗法（Carticel）。这是一种用患者自己的干细胞来修复受损伤的软骨的方法。
此外，美国在2011年11月也批准了首个造血祖细胞-脐带细胞疗法产品Hemacord。这也是一种干细胞产品，可用于造血系统疾病患者的造血干细胞移植，例如，用于治疗患某些白血病和一些遗传性代谢和免疫系统疾病的患者。Hemacord含有人类脐带血的造血祖细胞，实质上也是一种干细胞。脐带血是用于移植的造血祖细胞的三个来源之一，另两个来源是骨髓和外周血。一旦将造血祖细胞移植给患者，这些细胞就会迁移到骨髓，并在那里分裂并成熟。当成熟的细胞进入血液，它们可以部分或完全恢复多种血液细胞的数量和功能，包括免疫功能。因此，脐带血造血祖细胞疗法为患这类疾病的患者提供了挽救生命的治疗选择。
无论是干细胞药物还是干细胞疗法，都传递了一个信息，在干细胞治疗，包括技术（干细胞治疗或疗法现在归属于第三类疗法）和药物治疗上，全球各国的竞争日益激烈。但随之也产生了一个问题，干细胞治疗和干细胞药物会走向何方？干细胞治疗作为全球医药领域增长点最大和最有可能获得有效治疗结果的一种医疗手段，其治疗能否保证疗效与安全的完美统一？
为何prochymal能获得批准？
然而，在干细胞治疗的疗效和安全性问题上，医药界和公众目前是担心大于期盼，因为干细胞治疗现在是乱象丛生。在中国，干细胞治疗的乱象更为严重，可以归纳为几个方面：缺少监控、技术粗糙或低劣、夸大疗效、费用昂贵。虽然干细胞治疗的这些问题在世界各国都存在，但是，在管理较为严格的发达国家问题相对少一些。
移植物抗宿主病是骨髓移植（Bmt）后出现的多系统（皮肤、食管、胃肠、肝脏等）损害的全身性疾病，也是造成患者死亡的重要原因之一。而且，移植物抗宿主病的临床表现较为复杂，皮肤损害最早出现的症状有红斑、丘疹、水疱，甚至皮肤剥脱，严重者皮损可在数天内蔓延到全身。尽管移植物抗宿主病难以治疗，但奥西里斯治疗公司提供的临床试验数据表明，在一个小规模临床试验中61%～64％的严重难治性急性移植物抗宿主病患者使用prochymal28天后，症状得到改善。
另外，由于激素治疗移植物抗宿主病并不理想，高达80％患移植物抗宿主病的儿童至今仍没有药物治疗，而在上述临床试验中，参加者就是那些对激素类药物无反应的移植物抗宿主病儿童患者。基于这些原因，加拿大卫生部才批准该药上市。
但是，即便现在加拿大卫生部批准了prochymal治疗儿童急性移植物抗宿主病，也存在风险，因为，目前该药治疗移植物抗宿主病的作用机理还不完全清楚。另外，由于全球患儿童急性移植物抗宿主病也不过3500～4000人，其利弊大小也值得权衡。当然，奥西里斯治疗公司的做法也带有尝试性质。因为，尽管一些干细胞疗法获得了美国食品与药物管理局的批准，但美国迄今还未批准任何一种干细胞药物。而且，美国要求奥西里斯治疗公司提供更多关于prochymal有效的临床数据。所以，奥西里斯治疗公司先获取加拿大卫生部的批准就是要获取更多的临床试验治疗的数据。
从这个意义来看，美国和加拿大等国家对干细胞治疗药物的审批是非常严格的，值得借鉴学习。不过，中国的干细胞治疗可以从奥西里斯治疗公司的干细胞药物prochymal获得批准的过程获得一些宝贵经验。
干细胞疗法的探索和监管
干细胞药物和治疗首先需要严格审批，无论是国内还是国外专业界都认为，只有经过卫生主管部门批准的医疗单位和干细胞治疗技术或药物，才能进入临床使用。同时，即便经过批准，干细胞治疗也需要用相应的伦理治疗原则来规范。中国已经在制定《干细胞研究与应用伦理规范》，据悉，内容包括继续支持干细胞的研究与应用，并以严格区分临床前研究、临床试验和临床应用为前提。从临床前研究到临床试验属于研究范畴，不应向患者收费；临床应用则需经有关部门的行政审批。
此外，由于干细胞治疗是一项全新的医疗技术，没有成熟的经验和技术可以借鉴，因此干细胞治疗的各个领域会存在很多问题和风险，比如，可能引发肿瘤、产生免疫反应，甚至导致移植物抗宿主病（这主要是在引入他人的干细胞或动物干细胞治疗疾病时会发生）等，因此，应当汲取基因疗法的教训，其中一个重要的原则便是优后原则。优后原则是指对某种疾病在所有疗法都无效或微效时，才考虑使用干细胞治疗，而不是无论什么病都用干细胞治疗，尤其是像整容一类的领域不应当盲目使用干细胞疗法或干细胞药物。
另外，对于干细胞技术和药物，还应当对病人使用药物和技术进行全面监管和提醒。例如，美国批准了Hemacord用于临床治疗，但是要求在该产品的包装上带有黑框警告，提醒该产品可能有可致命的移植物抗宿主病、植入综合征、移植失败和输液反应等。并且，在治疗前应该在有造血干细胞移植经验的医生指导下进行的风险获益评价、脐带血库选择和管理。同时，医生应对接受治疗的患者仔细监测。
当然，干细胞治疗除了需要种种严格监管外，奥西里斯治疗公司的干细胞药物获得加拿大卫生部批准也指明了干细胞研究的一种方向，即利用较为成熟的干细胞技术才能既获得疗效，也能相应保证病人的安全。从干细胞研究的历程可以看出，胚胎干细胞由于涉及伦理，其研究和应用轻易很难突破。2006年日本研究人员发现导入四种转录因子，可使小鼠的成纤维细胞具备胚胎干细胞的表型和功能。随之，2007年，利用类似技术，研究人员又将人皮肤细胞诱导成类胚胎干细胞。因此，“诱导多能干细胞”（ipS）成为干细胞研究的一个分水岭。后来，英国研究人员又利用ipS技术成功将人皮肤细胞转化为肝细胞。
但是，所有这一切都是基础研究，还不可能进入临床试验，也根本不可能进入临床治疗。但利用间充质干细胞、成体干细胞或功能干细胞进行临床治病试验是目前比较可行的方法。例如，早在20世纪60年代，造血干细胞（间充质干细胞的一种）就应用于临床，主要用于治疗器官移植后的免疫修复等。造血干细胞也是目前为止研究最为透彻、临床应用最为广泛的干细胞疗法。
细胞生物治疗法篇2
【摘要】目的：探讨癌症在现阶段临床上的药物治疗情况及今后的发展方向；旨在为临床研究和治疗提供可靠。方法；通过对癌症在临床治疗上的问题、展望进行概略性介绍，着重利用新的生物技术和最新的治疗方法对抗癌症的努的研发是力。结果：传统癌症治疗主要还是以外科手术、放射线治疗及化学治疗为主，而化学药物的研发是利用化学有机合成小分子药物，然而寻找具有潜力的药物机率实在太低，目前以寻求的生物体内提取的小分子化合物，以配合组合化学（Combinationalchemistry）技术来提高药物的机率。结论：癌症治疗药物的研发将以基因药物为主流，虽然目前尚无此类药物成功上市，预期不远的将来，所有癌症将可利用新的基因技术，得到有效的控制及治疗。
【关键词】：癌症生物技术放射治疗免役疗法
由于抗生素的发明使得人类对感染性疾病能得到有效的控制，人类的寿命因而也大大延长，然而随着生命的延长，使得癌症与心血管疾病跃升为20世纪末的主要死亡原因。由此可见，对癌症的肆虐我们不可轻视。本文以近代重组基因工程技术及人类基因组译码为药物发展界碑，逐一介绍癌症药物的演进，旨在为生物科技研发提供参考依据。
20世纪对癌症的传统疗法
20世纪的癌症治疗主要还是以外科手术、放射线治疗及化学治疗为主，但严重的副作用使得病患畏于就医，而致病情延误，间接的造成治疗效果不彰，疾病无法有效根治等情形，以上三大疗法分述如下。
1.1外科手术（Surgery）
利用手术将固性肿瘤摘除（Lumpectomy），而肿瘤的摘除须于癌症的早期，癌细胞尚未转移时进行，但大多数的癌症未于早期发现，如胰脏癌、肝癌、肺癌、食道癌等，而且某些部位的癌症手术非常困难，如头颈癌及脑癌等；手术切除通常无法完全清除癌细胞，术后的复发可能性及因导致的癌细胞转移可能性也极高。
1.2放射线治疗（Radiotherapy）
利用放射线同位素如60C0，以体外照射的方式，对癌症细胞的基因造成破坏，使细胞死亡，但是放射线同时也会对正常的细胞造成伤害，目前以研发利用单株抗体结合放射线同位素或癌症化学药物，有如导弹的功能，直接攻击癌细胞，避免正常细胞遭受伤害，同时减少药物副作用。
1.3化学治疗（Chemotherapy）
化学疗法如同放射线疗发，大多数的化学药物是针对癌细胞快速生长的特色所施予的，但是对某些正常细胞如毛囊细胞或骨髓细胞等，生长快速的细胞仍会大幅度造成伤害，而导致免疫系统受损、掉发及呕吐等可能严重危及生命的副作用。一般使用的化学治疗药物有抑制核苷酸生成的抗代谢药物（如5—Fluorouracil、methotrexate等）、干扰基因复制的烷基化剂（如Cyclophosphamide、Chlorambucil、mechlorethamine等）、干扰酵素作用的抗生素类药物（如Dactinomycin、Doxorubicin等）、抑制有丝分裂的药物（如paclitaxel、Vincristine等）、类固醇或荷尔蒙拮抗剂（用以治疗对荷尔蒙敏感的肿瘤，如predmospne、tamoxifan等）1
2.20世纪末的抗癌药物
20世纪末，因为基因重组技术于1973年的发明，造成基因工程蛋白质药物的蓬勃发展，蛋白质癌症药物的发展也随新技术的开发而进入了新的时代；其中成功研发上市的药物有细胞激素类药物（Cytokine）、治疗用拟人单株抗体（Humanizedmonoclonalantiboby）等。
1免疫疗法（immunotherapy）
癌症的免疫疗法主要是利用细胞激素（蛋白质药物），刺激人体免疫系统，对癌细胞进行某些程度的攻击，目前上市的细胞激素主要有两类：干扰素（interferon，inF）及介白素（interleukin，iL），大多为1980年代所研发的产品。目前尚在研发中的产品有：细胞毒杀淋巴细胞生长因子（CytotoxicLymphocytematurationFactor，CLmF）、Gm—CSF、G—CSF、iL—3、iL—12等细胞激素（其中Gm—CSF、G—CSF为癌症病患接受化疗或放疗是，造血细胞所造成伤害的辅助治疗剂）。
2.2单株抗体（monclonalantiboby）
单株抗体是可与肿瘤细胞的特殊抗原（tumorspecificantigen）形成非常具特异性的结合，目前有些公司推出以肿瘤化学药物结合放射线同位素（如131i或99Yt）的方式，将药物带到癌细胞内而造成癌症细胞的伤害，并减少正常细胞的伤害。此外亦可利用单株抗体（monoclonalantibody）当作药物来直接治疗癌症，此药为单株抗体当作药物使用的良好典范2。
另一项治疗癌症的单株抗体药物Rituxan，以治疗低程度或微囊非何杰金氏淋巴癌，Rituxan是结合B细胞淋巴肿瘤细胞的表面抗原CD20的单株抗体，籍以降低肿瘤数量。
2.3研发中的其他药物
2.3.1抗血管生成（anti—giogenesis）药物目前唯一具有抑制血管生成的药物3，原先此药物是设计来抗溃疡的，但之后发现另一新作用为抑制胃癌恶化。目前此类抗血管生成药物大多数位于临床试验阶段，一般认为此类药物必须与化学疗法和放射线疗法并用，来控制癌细胞的生
细胞生物治疗法篇3
一、癌症治疗“三斧头”
目前，治疗癌症的手段很多，但主要还是手术、放疗、化疗这三种方法，人称治疗癌症的“三斧头”。实践证明，这三种疗法是有效的。癌症诊断得越早，治愈率也就越高，对早期肿瘤手术切除效果最佳，此为“第一斧”。有人统计，以乳腺癌为例，手术后5年生存率在国内已达到60～65％，其中一期(早期)病例5年生存率可高达90％以上，而三期病例为40～45％。被称为“癌中之王”的肝癌，早期手术5年生存率也较高，有的存活10年以上，甚至治愈。“第二斧”为化疗，化疗药物很多，应根据癌症的类型来选择，但这些药物最大的不足之处是选择性比较差，在杀伤癌细胞的同时，对正常细胞也有杀伤作用，使病人白细胞降低、免疫功能明显下降，这样，就为其它细菌或病毒的侵入开了“绿灯”。化疗适用于术前、术后或晚期肿瘤病人。“第三斧”为放射疗法，此疗法在恶性肿瘤的根治及姑息治疗方面起到很大的作用，主要用于体表部位恶性肿瘤，如皮肤、头颈部、五官、膀胱、子宫、直肠等癌肿。
二、癌症治疗中另一把“利斧”――免疫疗法
近年来，随着医学科学技术的迅速发展，免疫疗法已成为治疗癌症中高效、低毒的另一把“利斧”。免疫疗法的优越性为：①它是一种抗原抗体反应，具有“绝对”的特异性，仅杀伤癌细胞，而不损害正常细胞；②治疗作用为全身性，对已广泛播散转移的肿瘤也适用；③癌细胞都含有特异的肿瘤抗原，抗体能对它产生免疫反应，对癌细胞能达到彻底杀灭作用；④与传统“三斧头”相比，免疫治疗不会引起严重的功能损害。目前，肿瘤的免疫治疗方法很多，现简介疗效高、应用广泛者如下：
1.卡介苗：卡介苗是免疫激活剂，能激活体内免疫系统，刺激癌症病人防御功能，恢复免疫活性，促进人体对癌细胞的破坏和杀伤功能。如，膀胱内灌注卡介苗治疗膀胱癌，可减少复发率，肿瘤消失率为59～83％，对原位(早期)癌特别有效，对扁平型膀胱癌疗效尤佳。另外，卡介苗对肺癌手术后配合治疗也有很好的疗效。
2.白细胞介素-2：白细胞介素-2是一种免疫调节剂，它能增强某些淋巴细胞对癌细胞的杀伤力，人们称之为分化作用。白细胞介素-2具有活化能力，经过活化的淋巴细胞称为淋巴因子活化的杀伤细胞(LaK细胞)，LaK细胞具有很强的杀伤癌细胞的功能，可提高肿瘤的治愈率。有人应用LaK细胞治疗25例经常规治疗无效的癌转移病人，治疗后，25例中有11例肿瘤明显消退50％以上。
3.干扰素：干扰素是一组有抗病毒、抗肿瘤免疫作用的蛋白质。干扰素能直接抑制肿瘤细胞增殖，诱导增强机体免疫功能，包括增强自然杀伤细胞、单核细胞、淋巴因子激化杀伤细胞的活性。干扰素主要用于治疗成骨肉瘤、淋巴癌、乳腺癌、食管癌等。
4.肿瘤坏死因子：上世纪末，纽约外科医生首次报道了肿瘤病人受到细菌感染后，其肿瘤萎缩的病例，这一情况引起医学界的极大兴趣。经研究发现，是一种肿瘤坏死因子在起作用，它能杀伤癌细胞，导致肿瘤细胞坏死、结痂而得最终治愈。临床表明，肿瘤坏死因子对肺癌、乳腺癌、子宫癌、胃癌、黑色素瘤有较好疗效。
5.生物导弹：目前，最有希望的抗癌药被称为“魔弹”。这种药物是由特异性抗体作为“运载火箭”，将放射性核素、细胞毒性药物等带到病灶，这些抗癌物质如同“弹头”，因此人们又称之为、“生物导弹”。生物导弹能定向发射到肿瘤部位，起到杀伤和消灭癌细胞的作用，且不伤害健康细胞。目前，生物导弹用于治疗结肠癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤。
三、中医药治癌显奇效
细胞生物治疗法篇4
【关键词】肿瘤;细胞免疫疗法;分子生物学
机体免疫系统能够识别和清除肿瘤细胞已被许多实验明确证实。细胞免疫疗法通过提取人体最有力攻破癌细胞的免疫细胞，对其进行诱导、扩增、激活，使其具有识别和杀死肿瘤细胞的能力后再回输到病人体内，通过增强机体对肿瘤细胞的免疫应答能力的方式来抑制或消除肿瘤的生物细胞免疫疗法。近年来的研究显示，以免疫治疗为主体的肿瘤生物治疗已被公认为继手术、放疗和化疗后的肿瘤治疗的第四模式，其疗效已在多种肿瘤的治疗中得到验证。本文就细胞免疫疗法在临床多种癌症治疗中的应用进行综述。
1过继性细胞免疫治疗白血病
细胞免疫治疗成为白血病治疗中一个迅速发展的领域。armstrong等曾将白血病的细胞免疫治疗大致分为两类：一是输注可在体内刺激抗白血病活性的细胞，即疫苗治疗；二是输注有内在抗白血病活性的免疫效应细胞，即过继性细胞免疫治疗。有学者用肿瘤特异抗原（tSa）/肿瘤相关抗原（taa）的某些肽段致敏肿瘤患者缓解期自身t淋巴细胞，诱导产生特异性CtL，在体外可有效杀伤患者自身肿瘤细胞，而对正常造血细胞无毒作用。Sprent等报道了DC来源的exosomes能在体外直接诱导CD8+t细胞扩增，因此认为其在体外扩增抗原特异性CtL方面具有重要的理论和临床应用价值。乔建辉等在国内首次报道DSi能促进异基因造血干细胞移植后供者嵌合体的增加，有利于供者细胞植入，而且具有并发症少，较好的GVL效应等优势。最近一项针对半相合移植后复发患者的DSi临床报道显示，20例复发患者中有8例达到完全缓解，平均生存1118d，治疗效果比较满意。
2肺癌的细胞免疫疗法
免疫治疗是肺癌综合治疗的主要手段之一，细胞免疫治疗通过给机体输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法来达到治疗肿瘤的目的。许多动物实验和临床资料表明，iL一2／LaK细胞疗法具有抑制瘤、杀伤瘤作用。近来，ebina将BaK疗法应用于非小细胞肺癌(nSCLC)的治疗。该研究提示具有免疫活性的nSCLC患者更适合BaK疗法。BaK细胞治疗可纠正免疫功能低下，有利于延长nSCLC患者的生存期，提高生存质量。tiL细胞治疗结肠直肠癌、恶性黑色素瘤与肾细胞癌已显示一定的临床疗效。近年来，CD3aK细胞抗肿瘤作用的基础和临床应用研究取得了长足进展。杨新静等将CiK细胞用于肺癌的治疗研究，研究发现经过体外制备的CiK细胞不仅增殖速度快，而且对肺癌细胞体内外均具有高效的杀伤活性。
3卵巢癌的免疫治疗
卵巢癌是女性生殖器常见恶性肿瘤之一，近年来，有关卵巢癌免疫治疗方面的研究较多。Bjorge等指出，因为卵巢癌在远处转移前的相当长一段时间内都存在于腹膜腔内，并且卵巢癌术后遗留微小病变细胞处于休眠状态或至少处于低代谢率，所以卵巢癌非常适用于局部单克隆抗体的免疫治疗。过继细胞免疫治疗，其优点是绕过了机体免疫系统对肿瘤抗原的免疫耐受效应。Lambeck等研究了在卵巢癌患者体内的p53特异性t细胞反应，表明卵巢癌患者体内存在一种弱的混合型辅t细胞，即p53特异性t细胞可以诱导p53特异thl／CtL免疫，其研究结果支持了使用p53长肽作为瘤苗免疫策略的理论。卵巢癌的免疫治疗仍处于实验室研究阶段和部分临床前期研究阶段，需对肿瘤特异抗原、机体抗肿瘤免疫、肿瘤化疗与免疫治疗的时序等基础和临床问题进行更深入的研究。
4eBV病毒特异性CtL治疗鼻咽癌
鼻咽癌细胞表达HLai类分子，抗原递呈机制正常。鼻咽癌病人外周血中存在eBV特异性CtL，具备细胞免疫治疗的基础。Chua等报告eBV特异性多克隆CtL(5×107―3x108)治疗4例晚期鼻咽癌病人，除外周血eBV拷贝数降低外，没有观察到肿瘤缩小。Straathof等报告6例复发性／难治性鼻咽癌病人接受eBV特异性多克隆CtL(2×107／m2-2×10S／m2)后，CR2例，pR2例，SDl例，pD1例。5例病人的外周血eBV拷贝数在6周内明显降低，另1例在治疗前没有检测到eBV。eBV特异性多克隆CtL输注没有明显毒副作用。生物治疗技术的进步使鼻咽癌患者获得更多治疗机会，但是，鼻咽癌是地区性疾病。受到国际社会的关注程度有限，需要更多的循证医学证据来证实生物治疗对鼻咽癌的有效性。
随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学的发展，已能在体外培养出许多种类不同的特异性和非特异性的抗肿瘤效应细胞，尤其是肿瘤抗原的鉴定和合成、四聚体检测及分拣以及DC细胞的培养，使得能在体外成功地培养出大量的肿瘤特异性CtL细胞，真正开始了主动免疫和过继性免疫相结合的肿瘤特异性免疫治疗。细胞免疫治疗将与传统的肿瘤治疗(手术，化、放疗)和新的治疗方法如基因治疗、抗血管生成治疗等相联合，使其在肿瘤治疗中发挥重要的作用。
参考文献
细胞生物治疗法篇5
乳腺癌是一种全身性疾病，导致死亡的主要原因是远处转移，尤以脑、肺、骨转移多见。传统乳腺癌的治疗以手术为主，配合放化疗及内分泌治疗等。手术只能切除看得见的病灶，对于残存在血液和淋巴系统中的癌细胞却无能为力，因此存在复发和转移的风险。放化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也可杀死正常细胞，造成患者骨髓抑制、免疫力低下，同时肿瘤细胞对放化疗耐受。尤其是老年患者身体比较虚弱，常常不能承受放化疗所带来的痛苦。内分泌治疗仅对部分激素受体阳性的病人有一定效果，限制了其在临床中的应用。
目前，针对乳腺癌患者的生物免疫治疗联合手术及放化疗，已成为标准的综合治疗模式。生物免疫疗法是运用生物技术从病人体内采集免疫细胞，进行体外培养和扩增，然后回输到病人体内，以此来调动人体的免疫系统或扩增人体自身的抗肿瘤因子，从而实现控制肿瘤细胞生长、浸润转移的目的。该方法已成为继手术、放疗、化疗之后的第四大肿瘤治疗模式，并因其安全、有效、毒副作用小等优点，被认为是目前肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的手段。肿瘤生物治疗主要包括细胞因子治疗、自体免疫细胞治疗、单克隆抗体治疗、癌疫苗治疗、基因治疗、抗血管生成治疗等。目前临床应用最多的是自体免疫细胞治疗技术，如“DC+CiK生物治疗”技术：通过采集患者外周血中单个核细胞进行体外增殖培养，以获取成熟的具有肿瘤细胞识别能力的DC细胞和数量更多、更具活性和杀伤力的CiK细胞，并将这两种细胞分两次回输到患者体内，用它们来对肿瘤细胞进行特异性杀伤，就像导弹精确打击一样击中肿瘤细胞。
生物免疫治疗安全且毒副作用小，对乳腺癌患者具有明显的优势。
对于没有机会手术和复发转移的晚期乳腺癌病人，通过大量的自体免疫细胞移植，不但能迅速缓解肿瘤晚期的“恶液质”，而且还能提高生活质量（增加食欲、改善睡眠、增强体质等），延长生存期。
有效清除术后残余的癌细胞及微小病灶，预防乳腺癌复发转移。
与放化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作用和感染率，提高放化疗的疗效。
安全，无痛苦且毒副作用小。其副作用主要表现是发热，往往出现在注射后4~6小时，患者体温38~39度，持续约两个小时后可自行消退。一般情况下患者均能耐受，不需要特殊处理，对体质虚弱、无法进行放化疗的晚期患者依然适用。
可有效提高乳腺癌患者对放化疗的耐受能力，消除放化疗带来的毒副作用，恢复机体免疫功能，提高生存率，延长生存期。
由于生物免疫疗法的目的是提高患者自身的抗癌能力，因此，从根本上控制了肿瘤的生长，使肿瘤与机体处于一个平衡的状态，可使患者带瘤生存。
细胞生物治疗法篇6
【关键词】光动力疗法免疫疗法肿瘤
光动力疗法（photodynamictherapy，pDt）是近年来颇受各国学者重视的一种癌症新疗法。这种疗法是利用某些染料类光敏物质在癌组织中积聚的浓度高于周围的正常组织，在激光等照射下可产生对细胞有破坏作用的单线态氧（singletoxygen）及自由基的特性，从而干扰肿瘤细胞的生长并导致死亡。目前pDt已在临床上得到了较广泛的应用，一些光敏剂已被某些国家批准作为pDt药物，成千上万的癌症患者接受了pDt，并取得了很好的疗效。目前pDt主要应用于实体肿瘤的治疗，对某些晚期肿瘤、复发肿瘤和一些不适合手术的肿瘤，pDt也是一种有效和简便的姑息治疗手段。为了有效控制和根治恶性肿瘤，光动力学疗法与其他传统治疗手段联合的技术已逐渐被接受。近年有研究显示，pDt能激发宿主体内的免疫反应，而pDt和免疫治疗联合应用，能够提高和改善pDt诱发的抗肿瘤免疫反应，在肿瘤的治疗中起到重要的作用。目前这些方面的研究仍处于临床前期的动物实验阶段，现对光动力疗法联合免疫治疗的研究进展作一综述。
1光动力学疗法的抗肿瘤作用
1.1直接杀伤肿瘤细胞光动力疗法与传统的手术、化疗和放疗等肿瘤治疗手段相比，具有双重性选择的独特优点。首先，肿瘤组织能够选择性的储留光敏剂;其次，只有在光辐照的情况下，储留在组织中的光敏剂才能和组织中的氧分子发生生化反应产生对细胞具有毒性的活性氧（reactiveoxygenspecies，RoS），其中单态氧被一致认为是Ⅱ型pDt中最主要毒性物质，它们对细胞的破坏作用，将直接导致病变细胞发生坏死或凋亡。
1.2损伤血管效应肿瘤细胞的活力依靠血管供应的大量营养，pDt能损伤与肿瘤相关的脉管系统，导致肿瘤缺血性死亡，因此催生了抗血管光动力疗法（antiangiogenicpDt）——一种很有前景的治疗肿瘤的手段。如果在血管内光敏剂的浓度峰值期内照光，能够导致微血管损伤，病灶内供血不足，从而使细胞发生坏死或凋亡。
1.3抗肿瘤免疫效应1996年，Korbelik等[1]用正常的BaLB/c小鼠和免疫缺陷的小鼠比较了pDt对肿瘤的长时效应，发现肿瘤的复发更多的发生在免疫缺陷的小鼠中。在从有免疫活性的BaLB/c小鼠中移植了骨髓后，肿瘤复发率明显降低。说明pDt通过直接作用机制杀灭大多数肿瘤细胞后，仍需要免疫反应去清除剩余的癌细胞。Gollnick等[2]发现pDt后的肿瘤细胞本身就有很强的免疫原性，可激发特异性免疫反应。将pDt治疗后的肿瘤细胞制成匀浆液，接种于裸鼠体内，在没有任何免疫佐剂的情况下，可抑制同一种肿瘤细胞株的生长，但不能抑制其他肿瘤细胞株的生长。
2pDt的抗肿瘤免疫机制
目前的研究和应用的结果显示，pDt没有放疗和化疗那样明显的抑制机体免疫功能的副作用。相反，pDt可能诱导有益于治疗的抗肿瘤免疫反应，其抗肿瘤免疫的机制也包括细胞免疫和体液免疫。
2.1细胞免疫
2.1.1中性粒细胞中性粒细胞是pDt后最早到达肿瘤治疗部位的免疫细胞，其数量在骨髓、外周血以及肿瘤的治疗部位迅速增高，在pDt的抗肿瘤效应中发挥重要的作用。Sun等[3]发现pDt后中性粒细胞的活性在肿瘤的治疗部位增强，且肿瘤组织周围的中性粒细胞表达有mHCⅡ分子，说明中性粒细胞可能作为抗原提呈细胞参与pDt的抗肿瘤效应。
2.1.2自然杀伤细胞HendrakHennion等[4]应用Gm1抗体去除小鼠体内的nK细胞后，pDt抑制肿瘤生长的作用减弱，这提示nK细胞参与pDt的抗肿瘤效应。但用pDt治疗后的荷瘤小鼠脾内的nK细胞体外作用于肿瘤细胞发现，nK细胞不能杀伤肿瘤细胞，则说明nK细胞可能是由pDt的杀肿瘤细胞作用间接激活的。此外他还证实了nK细胞也参与pDt抑制肿瘤复发的作用，nK细胞可能通过分泌抗肿瘤细胞因子(如iFnγ、iL1、iL2和tnFα)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(antibodydependentcellmediatedcytotoxicity，aDCC)抑制肿瘤的复发。
2.1.3抗原提呈细胞体内重要的抗原提呈细胞有巨噬细胞、树突状细胞(DC)、B细胞等。这类细胞可摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给淋巴细胞，从而启动特异性免疫应答。Reiter等[5]发现pDt并不能直接激活巨噬细胞，而是其杀伤肿瘤细胞的作用间接激活了巨噬细胞的活性。实验发现，用二氧化硅微粒阻滞巨噬细胞的抗原提呈功能，可明显降低pDt的治愈率，这表明巨噬细胞的抗原提呈功能在pDt中发挥重要作用。Jalili等[6]发现DC可有效地吞噬被光毒性反应杀伤的肿瘤细胞，并将肿瘤抗原提呈给初始t细胞后使之激活，同时产生大量白细胞介素12(interleukin12，iL12)，促进初始t细胞产生th1型免疫应答。
2.2体液免疫
2.2.1补体pDt后，肿瘤组织内的血管内皮表面可见膜攻击复合物(membraneattackcomplex，maC)的广泛沉积，导致治疗部位的血供受阻，说明pDt可诱导补体系统的级联反应的激活。应用补体激活剂(如酵母多糖和链激酶等)，可增强pDt的抗肿瘤效应。但是补体激活剂在免疫缺陷小鼠体内不能增强pDt的疗效，说明补体的作用与各种免疫效应细胞的共同参与有关，pDt激活补体后产生了一系列活性片段，吸引带有补体受体的中性粒细胞、巨噬细胞和其他免疫效应细胞的聚集。近来有研究发现pDt后，肿瘤组织内补体C3水平持续增高，于24h达到高峰，而阻滞C3a受体和C5a受体的功能，会明显降低pDt的治愈率[7]。
2.2.2细胞因子光动力疗法可诱导iL1β、iL2、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnF)α、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，GCSF)产生。Sun等[3]在pDt治疗前分别应用iL1β、tnFα和GCSF的中和抗体作用于肿瘤组织，发现pDt的疗效降低，提示这些细胞因子在pDt的抗肿瘤效应中起到很重要的调节作用。还有研究发现，pDt治疗后的一定时间内，血管表皮生长因子的水平降低，其降低的程度越大，肿瘤体积缩小程度越明显，小鼠生存时间越长[8]。Gollnick等[9]长期致力于pDt抗肿瘤机制的研究，他们通过对pDt诱导的细胞因子、趋化因子和黏附因子的表达和中性粒细胞局部浸润现象的深入研究，发现不同的光敏剂所激活的细胞因子和炎性反应会有所不同。他们认为通过合理调控有益的炎性反应可能是优化光动力学疗法的抗肿瘤免疫作用的一个有效手段。
3光动力免疫疗法的研究进展
为了激发和增强机体的免疫功能，更好地控制恶性肿瘤，肿瘤的免疫治疗也日渐成为一个活跃的领域。免疫治疗包括主动免疫治疗和被动免疫治疗。主动免疫治疗是指给患者输入具有免疫原性的肿瘤疫苗，刺激机体的免疫系统产生特异性的抗肿瘤免疫。被动免疫治疗则是指给患者输入外源性的具有免疫效应的物质，由这些物质在患者体内发挥治疗肿瘤的作用。pDt和主动或被动免疫治疗相结合来治疗疾病，即光动力免疫疗法（photodynamicimmunotherapy，pDit），其有关研究已逐渐引起人们的关注。
3.1pDt瘤苗Canti等[10]认为，在引起细胞凋亡的剂量条件下，pDt作用可使得肿瘤细胞产生抗原性物质，并由抗原提呈细胞提呈给肿瘤特异性的t细胞。有动物实验显示，体外pDt处理的肿瘤细胞裂解物具有免疫原性，可看作是一种有效的肿瘤疫苗，这种通过pDt作用产生的疫苗，较紫外线或放射线作用产生的疫苗具有更强的抗原性，能够诱发特异的iFn分泌型细胞毒性t细胞并激活DC，能明显地提高接种疫苗的动物的生存率[2]。国内的黄慧芳等[11]通过研究两亲性酞菁锌光敏剂ZnpcS2p2介导的光动力疗法(ZnpcpDt)联合GmCSF、B7.1基因修饰的eL4细胞对小鼠淋巴瘤的抑制作用，发现mGmCSF、mB7.1基因修饰的瘤苗可明显增强ZnpcpDt的抗肿瘤效应。
3.2具有主动靶向功能的光敏剂由于肿瘤组织对光敏剂只是相对的选择性吸收，并不具备特异性，所以正常组织中不可避免的储留有少量的光敏剂，可能产生光毒副作用。当难以把光源局限在靶位组织，如腹腔和胸腔肿瘤时，为了减少对周围正常组织的毒副作用，开发靶向型的光敏剂就显得尤为重要。为了增强光敏剂的靶向作用，许多研究组纷纷开展了光敏剂的药物传输系统研究，变早期的被动靶向为现有的主动靶向输送方式，目前采用的主要方法有:免疫靶向光敏剂[12]、表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，eGFR）靶向光敏剂[13]、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）靶向光敏剂[14]、多肽靶向光敏剂[15]以及mRna靶向光敏剂[16]等。它们分别以高度特异性的肿瘤单克隆抗体（mab）、eFGRmab、LDL、胰岛素和转铁蛋白等多肽以及肿瘤基因的反义基因片段（如反义寡核苷酸）为载体，使光敏剂可以被特异性的靶向癌细胞，从而提高肿瘤细胞对光敏剂的特异性吸收，提高光动力学疗法的效率。
3.3过继免疫疗法（adoptiveimmunotherapy，ait）动物实验显示，光动力学疗法治愈的荷瘤动物的血清具有过继免疫性转移性。将治愈后动物的血清或脾细胞输入给同种动物，还可以诱发这些动物的免疫抗拒，抑制同种移植肿瘤的生长。
3.4免疫佐剂联合治疗（1）分支杆菌细胞壁提取物(mycobacteriumcellwallextract，mCwe)是一种非特异性免疫激活剂，Korbelik等[17]将pDt与mCwe联合应用于肿瘤的治疗，可明显增加免疫效应细胞的活性。（2）卡介苗可放大pDt治疗后t淋巴细胞介导的抗肿瘤效应，联合应用pDt和卡介苗可明显提高肿瘤的治愈率，抑制肿瘤的复发，且对正常组织的损伤程度减低。（3）二甲基磺醌醋酸(DmXaa)是一种抑制血管生成的细胞因子，可诱导tnFα产生。Bellnier等[18]联合应用低剂量的DmXaa和低剂量的pDt后发现，肿瘤的复发率和正常组织的损伤程度均明显降低。（4）补体激活剂将pDt与补体激活剂联合应用，如肿瘤局部应用酵母多糖或全身应用链激酶，可增强pDt的疗效，降低肿瘤的复发率[7]。（5）光敏剂吲哚菁绿（indocyaninegreen，iCG）和新型免疫佐剂——糖化壳聚糖(glycatedchitosan，GC)的激光免疫疗法(laserimmunotherapy，Lit)，成功地治愈了大鼠乳癌转移肿瘤[19]。新近的实验研究显示，糖化壳聚糖与血卟啉衍生物（photofrin）或酞菁类化合物（metatetrahydroxyphenylchlorin，mtHpC）光动力学疗法的联合使用，与单纯的光动力学疗法相比，前者可以明显地提高肿瘤治疗的效果。而且，糖化壳聚糖的免疫刺激作用较其他几种常用的免疫佐剂如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、短小棒状杆菌菌苗等的效果都要明显，pDt与糖化壳聚糖的联合使用有望很快进入临床试验。
3.5DC联合治疗近年来，以DC为基础的肿瘤疫苗研究已成为肿瘤免疫治疗的热点之一。DC是目前所认识的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞。在提呈“危险”信号如坏死组织或者微生物时，DC逐渐分化成熟，由周围组织进入次级淋巴器官，并激发t细胞反应。因此DC可以作为疫苗注射入体内，诱导特异性抗肿瘤和抗病毒免疫反应。目前有人研究体内直接用肿瘤抗原负载DC的方法，并初步证实脂质体介导的多肽抗原体内负载DC，可诱导特异性抗肿瘤和抗病毒免疫反应。另外Jalili等[6]研究发现，在pDt治疗的肿瘤组织内接种非成熟的DC（intratumoralinjectionofnaivedendtiticcells，itDC），可以加强pDt的抗肿瘤效应。Saji等[20]研究也指出，pDt和itDC联合治疗杀伤肿瘤细胞的作用比单独进行局部pDt或者itDC效果更明显，荷瘤鼠的生存期明显延长，更重要的是联合治疗应用于局部可使远处的肿瘤消失，如多发性的肺转移灶等。同时，将脾细胞输入同种动物能诱发这些动物发生免疫抗拒，这是由于脾内含有肿瘤特异性的细胞毒性iFnγ分泌型的t细胞。
4结语
由于目前认为免疫治疗还只能清除少量的和播散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤的疗效还有一定的局限性，只能作为一个辅助疗法。而pDt与免疫疗法的联合应用，可以进一步提高和改善pDt诱发的抗肿瘤免疫反应。在系统性和长效的抗肿瘤免疫的参与下pDt能达到抗局部原发肿瘤、甚至抗转移肿瘤和防止肿瘤复发等多种治疗效果。目前这些方面的研究仍限于临床前期的动物实验，临床研究尚有待加强。但随着研究的进一步深入，pDt在肿瘤治疗和预防复发方面将有更大的应用前景。
参考文献
[1]Korbelikm，KroslG，KroslJ，etal.theroleofhostlymphoidpopulationsintheresponseofmouseemt6tumortophotodynamictherapy[J].CancerRes，1996，56(24):5647-5652.
[2]GollnickSo，VaughanL，HendersonBw.Generationofeffectiveantitumorvaccinesusingphotodynamictherapy[J].CancerRes，2002，62(6):1604-1608.
[3]SunJ，Cecici，parkinsCS，etal.neutrophilsasinflammatoryandimmuneeffectorsinphotodynamictherapytreatedmouseSCCViitumours[J].photochemphotobiolSci，2002，1(9):690-695.
[4]HendrzakHenionJa，KniselytL，CincottaL，etal.Roleoftheimmunesysteminmediatingtheantitumoreffectofbenzophenothiazinephotodynamictherapy[J].photochemphotobiol，1999，69(5):575-581.
[5]Reiteri，SchwambergerG，KrammerB.activationofmacrophagetumoricidalactivitybyphotodynamictreatmentinvitroindirectactivationofmacrophagesbyphotodynamicallykilledtumorcells[J].JphotochemphotobiolB，1999，50(2-3):99-107.
[6]Jalilia，makowskim，Switajt，etal.effectivephotoimmunotherapyofmurinecoloncarcinomainducedbythecombinationofphotodynamictherapyanddendriticcells[J].ClinCancerRes，2004，10(13):4498-4508.
[7]Cecici，SerranoK，Gyongyossyissam，etal.Characteristicsofcomplementactivationinmicebearinglewislungcarcinomastreatedbyphotodynamictherapy[J].CancerLett，2005，225(2):215-223.
[8]osieckaBJ，Ziolkowskip，Gamiane，etal.DeterminationofvascularendothelialgrowthfactorlevelsinserumfromtumorbearingBaLB/cmicetreatedwithphotodynamictherapy[J].medScimonit，2003，9(4):BR110-114.
[9]GollnickSo，evansSS，BaumannH，etal.Roleofcytokinesinphotodynamictherapyinducedlocalandsystemicinflammation[J].BrJCancer，2003，88(11):1772-1779.
[10]CantiG，DeSimonea，Korbelikm.photodynamictherapyandtheimmunesysteminexperimentaloncology[J].photochemphotobiolSci，2002，1(1):79-80.
[11]黄慧芳，陈元仲，吴勇，等.ZnpcS2p2介导的光动力疗法联合mGmCSF、mB7.1基因修饰的瘤苗治疗小鼠淋巴瘤[J].细胞与分子免疫学杂志，2006，22(1):99-102.
[12]malatestin，SmithK，SavoieH，etal.Synthesisandinvitroinvestigationofcationic5，15diphenylporphyrinmonoclonalantibodyconjugatesastargetedphotodynamicsensitisers[J].intJoncol，2006，28(6):1561-1569.
[13]delCarmenmG，Rizvii，ChangY，etal.Synergismofepidermalgrowthfactorreceptortargetedimmunotherapywithphotodynamictreatmentofovariancancerinvivo[J].JnatlCancerinst，2005，97(20):1516-1524.
[14]ZhengG，ChenJ，LiH，etal.Reroutinglipoproteinnanoparticlestoselectedalternatereceptorsforthetargeteddeliveryofcancerdiagnosticandtherapeuticagents[J].procnatlacadSciUSa，2005，102(49):17757-17762.
[15]LaptevR，nisnevitchm，SiboniG，etal.intracellularchemiluminescenceactivatestargetedphotodynamicdestructionofleukaemiccells[J].BrJCancer，2006，95(2):189-196.
[16]ChenJ，StefflovaK，niedremJ，etal.proteasetriggeredphotosensitizingbeaconbasedonsingletoxygenquenchingandactivation[J].JamChemSoc，2004，126(37):11450-11451.
[17]Korbelikm，Cecici.enhancementoftumourresponsetophotodynamictherapybyadjuvantmycobacteriumcellwalltreatment[J].JphotochemphotobiolB，1998，44(2):151-158.
[18]BellnierDa，GollnickSo，CamachoSH，etal.treatmentwiththetumornecrosisfactoralphainducingdrug5，6dimethylxanthenone4aceticacidenhancestheantitumoractivityofthephotodynamictherapyofRiF1mousetumors[J].CancerRes，2003，63(22):7584-7590.
细胞生物治疗法篇7
【关键词】维血宁干扰素白细胞减少
干扰素仍是慢性病毒性肝炎治疗的首选药物之一，尤其对于慢性丙型肝炎治疗没有其他药物可以替代。其不良反应也是困扰临床医生乃至决定抗病毒治疗能否进行下去的原因之一。故其不良反应也越来越引起人们的重视，其中外周血白细胞在治疗的第1月内常有25%～50%的减少［1］，如不及时纠正，不仅会影响抗病毒治疗的顺应性，而且由于白细胞减少，机体免疫功能下降，容易诱发感染。笔者自2006年4月～2007年4月，运用维血宁共治疗干扰素所致外周血白细胞减少54例，疗效满意，报道如下：
1资料与方法
1.1临床资料54例均为我院肝病门诊或住院病人，其中男41例，女23例；年龄16～62岁，平均年龄42.6岁；病程5～30年，平均12.3年；均符合中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合制定的《病毒性肝炎防治方案》的病毒性肝炎诊断标准。
1.2检测方法在治疗前和治疗后(2周)均行血常规五分类检查(由我院检验科协助完成)。
1.3治疗方法外周血白细胞(wBC)4.0×109/L为治愈。
1.4疗效判断标准按照卫生部《中药新药临床研究指导原则》中升白细胞药物疗效标准判断，显效:治疗后外周血白细胞升高至4.0×109/L以上，并在疗程中能保持疗效到停药2周后，症状显著减轻或消失；有效:白细胞数比治疗前上升(0.5～1.0)×109/L，但未达到4.0×109/L水平，在疗程中能维持疗效直到停药2周，症状有所好转；无效：治疗后白细胞数升高，但比较治疗前后白细胞升高值，用t检验进行统计学处理后，少于0.5×109/L，症状无好转。
1.5试验研究方法采用自身前后对照研究方法，在试验中病人不分组，凡血常规符合白细胞减少诊断标准的慢性乙型、丙型肝炎患者，均采用维血宁口服液治疗，疗程结束进行血常规检测，前后对照比较得出结果。
2结果
2.1疗效结果显效39例，有效8例，无效7例，显效率72.2%，总有效率87.04%。
2.2外周血白细胞变化情况治疗前wBC3.05±0.86;治疗后wBC4.60±0.76。与治疗前比较：p＜0.01。
3讨论
病毒性肝炎是常见的传染病，尽管目前治疗该病的药物很多，但对慢性乙肝和丙肝仍无十分理想的药物，干扰素(iFn)作为治疗慢性乙肝和丙肝的病原治疗虽然不是最理想的药物，但国内外专家一致认为是目前治疗慢性乙肝和丙肝的首选药物之一。它是病毒进入机体后诱导宿主细胞产生的反应物，是细胞内能够阻止病毒复制的一种特殊蛋白质；在抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等方面有良好作用。干扰素是FDa最早批准用于肝炎治疗的抗病毒药物而被广泛应用于临床。但是，由于该药物存在诸多的不良反应，尤其是疗程的头3个月对骨髓的抑制作用，使部分病人因中性粒细胞下降而影响抗病毒治疗的顺应性。减少剂量或停药，常可使不良反应消失，是处理不良反应最常用的方法，但是减少剂量和停药可使疗效降低。最大程度维持有效剂量是保证抗病毒药物疗效的重要措施［2］，这是目前抗病毒治疗的共识。怎样在不影响抗病毒治疗疗效的情况下处理干扰素的不良反应，以维持治疗方案顺利进行，提高患者生存质量，是临床急待解决的问题。中医并无白细胞减少症病名，但多认为与精血亏少有关，归属于“虚劳”范畴。笔者在临床发现，多数此类病人都存在不同程度的脏腑亏损，气血阴阳不足的表现，可能与肝病日久，耗血伤阴，伤气损阳，瘀血内结，新血不生，最终致精亏血少有关。因此，主张治以补益之法。维血宁具有补血活血，清热凉血之功，能调节机体免疫机制，提高骨髓的造血功能，有效防治干扰素引起的骨髓抑制的不良反应。方中熟地黄养血滋阴，补精益髓，为补血之要药，白芍则养血敛阴，与熟地相合，最善补血，是为君药；太子参归肺、脾经，补气生津，“气为血之帅”，气生则血生，生地甘、苦、寒，长于清热凉血，养阴生津，墨旱莲归肝肾经，滋阴益肾，凉血止血，共为臣药；仙鹤草、鸡血藤调气补血，行血补血，佐以虎杖苦寒活血，全方共奏补益之功。现代药理研究证明，太子参等可刺激骨髓增生，提高造血因子的分泌［3］；仙鹤草、鸡血藤具有保护人体造血系统，改善骨髓微循环，促进造血细胞核糖核酸合成和多能干细胞增殖与分化，具有显著增高白细胞的作用［4］。
【参考文献】
［1］moranteaJL，saez-RoyuealF，ValeroFC，etal.immunethrombocytopeniaafteralpta-interferontherapyinapatientwithchronichepatitisC［J］.amJGastroenteral，1992，87:809.
［2］Russomw.Friedmw.SideeffectsoftherapyforchronichepatitisC［J］.Gastroenterolopy.2003，124:1171-1719.
细胞生物治疗法篇8
【摘要】目的:研究131i标记的Rituximab对B细胞淋巴瘤细胞的生物学效应以及对荷人Raji细胞移植瘤裸鼠的放射免疫治疗效果，为放射免疫导向治疗提供实验依据。方法：体外培养人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞，裸鼠皮下接种Raji细胞成瘤，ioDo-Gen法将131i标记于Rituximab，将细胞分为131i-Rituximab组、单纯抗体组、单纯核素组及空白对照组4组，流式细胞仪检测各组Raji细胞凋亡和细胞周期；取30只成瘤裸鼠随机分成高、中、低剂量治疗组及单纯抗体组、单纯核素组、空白对照组6组，进行裸鼠的放射免疫治疗研究。每周测量裸鼠荷瘤大小1次，4周后处死裸鼠，取瘤称重，常规病理分析。结果：131i-Rituximab组凋亡率高于其他各组；131i-Rituximab组细胞周期发生变化，大部分被阻滞在G2期。裸鼠各治疗组与对照组比较，肿瘤生长减慢，肿瘤生长抑制率具有剂量时间依赖性，组织病理学检测显示治疗有效。结论：131i-Rituximab能够诱导Raji细胞凋亡并调控细胞周期，而且可特异性地定位于肿瘤组织，发挥放射免疫导向治疗作用，具有潜在的临床应用价值。
【关键词】放射免疫治疗；B细胞淋巴瘤；抗CD20单克隆抗体；131i-Rituximab
非霍奇金淋巴瘤（nHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤之一，其绝大多数是B细胞来源，放射免疫治疗（Rit）属于内照射治疗，已成为目前B细胞nHL治疗的研究热点。本实验将Rituximab-人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体偶联放射性核素131i，从体外和体内实验两方面研究其对B细胞淋巴瘤的生物学效应。
1材料与方法
1.1细胞与实验动物
人B淋巴瘤细胞系Raji细胞购于中国科学院上海细胞研究所；BaLB/c裸鼠（4～6周龄）购于中国科学院上海实验动物中心，于东南大学医学院SpF动物房饲养。
1.2主要试剂及器材
Rituximab购于罗氏制药公司，na131i购于南京森科公司，iodogen(四氯二苯基甘脲)由苏州大学医学院核医学实验室提供，流式细胞仪为FaCSVantageSe型，SpeCt显像仪为德国西门子公司e.Cam9358型。
1.3细胞培养
用含10%胎牛血清、100U·ml-1青霉素、100U·ml-1链霉素的Rpmi1640培养液，在37℃、5%Co2、95%湿度的培养箱中培养，2～3d传代1次，取对数生长期细胞用流式细胞仪测定CD20表达率。
1.4131i-Rituximab的制备
应用ioDo-Gen法［1］标记，标记产物经SephadexG-25分离纯化，检测标记产物的标记率及放射化学纯度。
1.5体外实验
1.5.1分组细胞换液后24h，将细胞浓度调整为1×106ml-1，分为4组。a组（131i-Rituximab组）：将131i-Rituximab加入Raji细胞中，使131i-Rituximab的最终比放射性活度为3μCi·ml-1（1Ci=37GBq），Rituximab的最终浓度为50μg·ml-1；B组（单纯核素组）：将na131i加入Raji细胞中，使na131i的最终比放射性活度为3μCi·ml-1；C组（单纯抗体组）：将Rituximab加入Raji细胞中，使Rituximab的最终浓度为50μg·ml-1；D组（空白对照组）：加入等量培养液。上述各组剂量参照文献［2］确定。
1.5.2观察指标加药24h后显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期：以annexinⅤ-FiFC/pi双染法测定药物对细胞的早期诱导凋亡作用，采用Dna倍体分析法检测细胞周期，重复测定3次。
1.6体内实验
1.6.1B细胞淋巴瘤动物模型的建立将处于对数生长期的Raji细胞，用不含血清的Rpmi1640调整细胞密度为1×107ml-1，每只裸鼠皮下接种0.2ml，30d后部分裸鼠成瘤，挑选肿瘤直径约为0.8cm的30只成瘤裸鼠进行实验分组。
1.6.2实验动物分组成瘤裸鼠模型随机分为6组（每组5只）。a组（高剂量组）：尾静脉注射131i-Rituximab400μCi；b组（中剂量组）：尾静脉注射131i-Rituximab150μCi；c组（低剂量组）：尾静脉注射131i-Rituximab50μCi；d组（单纯抗体组）：尾静脉注射Rituximab0.8mg；e组（单纯核素组）：尾静脉注射na131i150μCi；f组（空白对照组）：尾静脉注射生理盐水0.2ml。上述各组剂量参照文献［3］确定。
1.6.3治疗效果观察（1）观察实验动物的一般状况包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况，并称体重；（2）每隔3～4d测量肿瘤的长径和短径，根据公式计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率（iR）：V=ab2/2（a为长径，b为短径），iR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治疗组的肿瘤体积，Vn为治疗组的肿瘤体积)；（3）SpeCt显像：分别于注射后4、24、48、72、96、168h显像；（4）组织病理学检测：治疗4周后处死裸鼠分离肿瘤，称重后用10%福尔马林固定，He染色，作常规病理检查。
1.7统计学处理
采用SpSS13.0软件处理，进行方差分析，两两比较采用LSD法。
2结
果
2.1Raji细胞形态改变及CD20表达率
倒置显微镜下可见细胞为圆形，生长旺盛，聚集成团，透明度高，折光性强。流式细胞仪测定CD20表达率为98.03％。
2.2131i-Rituximab的标记率及放化纯度
131i-Rituximab采用纸层析法测其标记率为90％，其稳定性好，4℃贮存24h，其放化纯度为91％。
2.3体外实验结果
2.3.1镜下细胞形态学改变a、B、C组细胞生长受到抑制，数量减少，细胞收缩，胞核变小。
2.3.2细胞凋亡情况细胞凋亡率a组为59.94％，B、C、D组依次为48.21％、40.40％、1.06％，各组间差异具有统计学意义(p
2.3.3细胞周期分析（1）a组有17.13%的细胞截止于S期，B、C、D组依次有24.31%、25.73%、33.32%，除B组和C组之间差异没有统计学意义以外，余各组间差异有统计学意义(p
2.4体内实验结果
2.4.1实验动物的一般情况b组裸鼠精神状况、活动度、皮肤状况、饮食饮水量及体重均未发现明显异常变化；a、c和d组裸鼠精神情况尚可，活动度较b组略差，饮食饮水量轻度减少；e组和f组在实验后期裸鼠精神萎靡，皮肤暗淡，体重减轻，饮食饮水量明显减少。a组分别在注射后第2、3天各有一裸鼠死亡，说明剂量过高，射线对裸鼠本身有一定伤害作用。
2.4.2131i-Rituximab对肿瘤的抑制情况如图1所示：a、b组随时间的延长肿瘤体积无明显增大甚至有所缩小，c、d组随时间的延长肿瘤体积稍增大，e、f组随时间的延长肿瘤体积有明显增大。各组裸鼠经治疗后第4周计算肿瘤生长抑制率，结果，a、b、c、d、e组依次为48.69％、47.60%、29.60％、17.27％、6.81％，各治疗组与对照组之间差异具有统计学意义(p
2.4.3SpeCt显像给药后4、24、48、72、96及168h利用SpeCt显像。于注射后4h肿瘤未见明显显影，周围组织及血本底较高；24、48h后a、b、c组可见肿瘤部位放射性浓聚（图2），e组未见明显肿瘤部位浓聚；72、96及168ha、b、c3组可见肿瘤图像逐渐变浅；24hb组可见肿瘤部位放射性浓聚。
2.4.4病理观察结果e、f组肿瘤细胞增生活跃，可见较多的病理性核分裂相，偶见小灶性坏死；c、d组瘤细胞体积缩小，病理性核分裂相可见，肿瘤细胞核固缩、结构不清、破裂，肿瘤组织见小片坏死，部分区域肿瘤细胞全部坏死、消失；a、b组瘤细胞体积明显缩小，病理性核分裂相可见，肿瘤组织见大片坏死（图3）。
3讨
论
放射免疫治疗（Rit）是近几年在分子靶向治疗基础上发展起来的新的治疗方法，即利用特异性抗体作载体，与能释放射线的放射性核素偶合，注入体内与肿瘤细胞特异性结合，实现对瘤体的内照射治疗，它不仅能杀伤与抗体结合的肿瘤细胞，还能杀伤邻近的不表达抗原及无法与抗体结合的细胞。
Rit淋巴瘤具有许多优势［4-6］：（1）淋巴瘤细胞对射线具有高度敏感性；（2）Rit通过射线杀伤肿瘤，不必完全依赖补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（aDCC），因此即使机体免疫缺陷、抗原表达阴性或肿瘤免疫逃避等导致抗体及免疫毒素无效时，内照射仍可发挥作用；（3）标记抗体本身固有强大的抗肿瘤效应；（4）放射性核素释放的β射线能穿透多个细胞直径的距离，因此对于周围抗原表达阴性而没有结合核素的肿瘤细胞同样也有杀伤作用，这种作用称为“交叉火力作用”（crossfire）；（5）与传统的分次、短时、高剂量外照射治疗相比，Rit为持续性低剂量内照射治疗，避免肿瘤细胞在放疗间隔期Dna的修复，且持续低剂量辐射使肿瘤细胞被阻止在对射线敏感的细胞周期G2期，从而增加放射性细胞毒作用。国外对该方面研究成果显著：90Y-ibritumomab和131i-tositumomab已被FDa批准用于难治、复发性nHL及CD20阳性的转型nHL的治疗［7］。
本实验从体外和体内实验两方面研究131i标记的Rituximab对B细胞淋巴瘤的生物学效应：体内实验观察131i-Rituximab对Raji细胞的早期凋亡及细胞周期的影响，体外实验观察131i-Rituximab对荷B细胞淋巴瘤裸鼠的治疗效果。选用ioDo-Gen法把131i标记到Rituximab上标记方法简单，标记率及放化纯度均在90％以上，标记物稳定，证明ioDo-Gen法有很强的实用性。Raji细胞的CD20表达率达98.03%，证明CD20是放免治疗B细胞淋巴瘤的良好靶点［8］，131i-Rituximab可与Raji细胞表面抗原CD20特异性结合，将131i固定到肿瘤细胞，131i所发射的β射线对肿瘤细胞产生辐射生物效应［9］，Rituximab在行使载体功能［8］的同时，其所产生的补体依赖的CDC和aDCC［10］共同作用抑制肿瘤生长。
体外实验中，由于131i-Rituximab中131i所发射的射线对细胞产生的辐射生物效应，使细胞内Dna断裂、交联，影响了Dna的复制和细胞的有丝分裂。本研究显示，131i-Rituximab作用于Raji细胞后其凋亡率为59.94％，而单纯抗体组仅为40.40％。131i-Rituximab组有17.13%截止于S期，单纯核素组、单纯抗体组、对照组依次为24.31%、25.73%、33.32%，提示治疗组肿瘤细胞增殖状态不佳；131i-Rituximab组有69.01%截止于G2期，单纯核素组、单纯抗体组、对照组依次为65.10%、51.83%、50.13%，提示射线将肿瘤细胞阻滞于G2期，阻止细胞进一步分裂。以上说明131i-Rituximab具有生物导向的治疗作用，通过持续低剂量辐射，使细胞被阻止在对射线最敏感的有丝分裂期，增强放射性细胞毒作用。
体内实验中，从6组裸鼠肿瘤的增生情况及治疗后第4周对肿瘤生长的iR来看，单独使用Rituximab已经有一定的抑瘤效果，其抑瘤率达到17.27％；使用低剂量131i-Rituximab的抑瘤效果要好于单独使用Rituximab的效果，这说明核素在其中起了增强作用；中剂量131i-Rituximab组的抑瘤效果最明显，甚至使肿瘤略缩小；高剂量131i-Rituximab组由于剂量太高，虽然也有明显的抑瘤效果，但是造成了正常组织的损伤，治疗效果不理想。
总之，131i-Rituximab在体内和体外均显示了较强的特异性杀肿瘤作用，适合以后作为免疫导向治疗的药物，针对B细胞淋巴瘤高表达的CD20抗原作为治疗靶点的免疫导向治疗前景乐观。肿瘤放射免疫治疗的发展为难治性复发性B细胞nHL治疗开辟了新的天地。通过131i-Rituximab对B细胞淋巴瘤生物学效应的实验研究，希望能够为其进一步临床应用提供实验依据。
参考文献
［1］FRaKeRpJ，SpeCKJR.proteinandcellmembraneiodinationswithasparinglysolublechloroamide，1，3，4，6-tetrachloro-3a，6a-diphrenyl-glycoluril［J］.BiochemBiophysResCommun，1978，80(4)：849-857.
［2］范冬梅，赖增祖，熊冬生，等.嵌合抗CD20Fab对B淋巴瘤细胞Raji细胞生长的影响［J］.中国肿瘤临床，2001，28（6）：415-417.
［3］曾亮，林斯骏，葛锡锐，等.抗肺癌单克隆抗体LC-1结合90钇对荷肺癌裸鼠的放射免疫治疗实验研究［J］.中国肺癌杂志，2003，6(4):258-260.
［4］pReSSow，RaSeYJ.principlesofradioimmunotherapyforhematologistsandoncologists［J］.Seminoncol，2000，27(6Suppl12)：62-73.
［5］witZiGte.Yttrium-90-ibritumomabtiuxetanradioimmunotherapy:anewtreratmentapproachforB-cellnon-Hodgkinslymphoma［J］.Drugstoday，2004，40：111-119.
［6］CHeSonBD.Radioimmunotherapyofnon-Hodgkinlymphomas［J］.Blood，2003，101(2)：391-397.
［7］pReSSow.physicsforpractitioners：theuseofradiclabeledmonoclonalantibodiesinB-cellnon-Hodgkinslymphoma［J］.SeminHematol，2000，37(Suppl7)：2-8.
［8］emStJa，LiH，KimHS，etal.isolationandcharacterizationoftheB-cellmarkerCD20［J］.Biochemistry，2005，44(46):15150-15158.
［9］GaiKL，SammYe.Single-cellcytotoxicitywithradiolabeledantibodies［J］.ClinCancerRes，2001，7(1)：192-201.
细胞生物治疗法篇9
【摘要】目的探讨小剂量顺铂增加人宫颈癌Hela和Siha细胞系对光动力治疗的敏感性及细胞凋亡的机理。方法将Hela和Siha细胞分为空白对照组、单纯光动力治疗组、单纯顺铂治疗组和光动力加顺铂治疗组，mtt法检测各组人宫颈癌细胞株Hela和Siha的增殖情况。采用免疫细胞化学法检测各组Hela和Siha细胞受作用后p185cerbB2蛋白的表达情况。结果顺铂和光动力治疗联合应用导致细胞凋亡的程度均明显强于单一顺铂作用或光动力作用，细胞中p185cerbB2蛋白的表达下降程度也与之相一致。但是先顺铂后光动力治疗和先光动力治疗后顺铂相比，作用效果差异不明显。结论顺铂和光动力联合治疗在体外对人宫颈癌Hela和Siha细胞有明显增殖抑制作用，强于单独一种方法治疗，其机理可能与抑制p185cerbB2表达有关。
【关键词】5氨基酮戊酸;顺铂;光动力疗法;免疫细胞化学;宫颈癌细胞株
aBStRaCt:objectivetoinvestigatethemechanismofsmalldosecisplatininenhancingphotodynamictherapysensitivityandapoptosisinhumancervicalcarcinomacelllines.methodstheHelaandSihacellswerepidedintofourgroups(blankcontrolgroup，photodynamictherapyonly，cisplatinonly，photodynamictherapyandcisplatin).theeffectsonproliferationofHelaandSihacellsinthefourgroupswereexaminedbymttassay.theexpressionofp185cerbB2inHelaandSihacellsaffectedwasdetectedbyimmunocytochemistry.Resultsthedegreeofapoptosiscausedbythejointapplicationofcisplatinandphotodynamictherapywasgreaterthanthatcausedbycisplatinorphotodynamictherapyalone.theexpressionofp185cerbB2incellsdeclinedcorrespondingly.However，theorderofcisplatinandphotodynamictherapydidnotcauseobviousdifferencesintheeffect.ConclusiontheinvitroproliferationofHelaandSihacellsisrestrainedobviouslybycisplatincombinedwithphotodynamictherapy;theeffectisgreaterthanthatofcisplatinorphotodynamictherapyonly.themechanismofcispatinsenhancementofphotodynamictherapysensitivitymayberelatedtoinhibitingp185cerbB2expression.
KeYwoRDS:5aminolevulinicacid;cisplatin;photodynamictherapy;immunohistochemistry;cervicalcarcinomacellline
顺铂(cisplatin)全称为顺式二氯二氨铂(cisdiamminedichloroplatinum，DDp或CDDp)，是广泛应用于宫颈癌治疗的化疗药物[1]。但是，由于肿瘤细胞耐药性的存在，顺铂的治疗效果有待进一步提高。如何在不增加用药量和毒副作用的前提下，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，成为近年来研究的方向[2]。
5氨基酮戊酸(5aminolevulinicacid，aLa)局部给药结合可见光辐照进行光动力治疗(photodynamictherapy，aLapDt)是近年来兴起的一种肿瘤消融新技术，已广泛应用于治疗各种体表肿瘤。aLa是一种简单的无碳化合物，是内源性化学物质，参与体内血红素的生物合成。作为血红素的前体物，aLa在aLa脱水酶等一系列酶作用下生成具有强光敏作用的原卟啉Ⅸ(protoporphyrinⅨ，ppⅨ)，它是血红素生物合成的最后一步中间体。正常情况下，血红素生物合成途径受机体负反馈机制调节，即aLa的合成受细胞内血红素含量调节，所以体内不会有过多的aLa蓄积。当给予过多的外源性aLa时，上述调节机制被打乱，机体某些增殖较快的组织或者某些肿瘤细胞即产生过量的ppⅨ，此时经激光辐照即发生光动力学反应，生成具有杀伤细胞作用的单线态氧或其他自由基等细胞毒性物质，杀伤肿瘤细胞达到治疗目的[3]。
Her2/neu又称cerbB2基因，其编码的蛋白质称p185cerbB2，是一种跨膜受体糖蛋白，主要定位于细胞膜，为一种具有酪氨酸激酶活性的细胞膜受体。p185cerbB2过量表达的肿瘤恶性程度高，术后易发生转移和复发，并且对化疗药物治疗具有耐药性。因此，检测p185cerbB2是否高表达，对多种肿瘤的鉴别诊断、分类预示疗效及判断预后乃至治疗方案选择均有重要意义[4]。
近年来，有关药物对放射治疗肿瘤起到增敏增效的研究越来越多并获得一定成果[5]。本研究通过对体外培养的人宫颈癌Hela和Siha细胞进行单纯小剂量顺铂作用、单纯光动力作用、顺铂联合光动力作用后，观察细胞增殖及调节蛋白表达的变化，探讨两种作用联合应用的增敏效应。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器顺铂由齐鲁制药厂生产;aLa购自上海红绿光敏剂研究所;annexinVFitC/pi购自美国Biovision公司;p185cerbB2兔单克隆抗体为美国abcam公司产品;免疫组化染色试剂盒、浓缩型DaB试剂盒购自北京中山金桥公司。紫外分光光度计为岛津苏州有限公司产品;荧光图像扫描分析仪为VistraFluorescence公司产品;流式细胞仪为BDFaCSCalibur公司产品;酶标仪为日本eYeLa公司产品;艾拉XD635aB型光动力(pDt)激光治疗仪由上海复旦张江生物医药股份有限公司生产。
1.2细胞培养人宫颈癌细胞系Hela、Siha取自山东大学齐鲁医院低温实验室。细胞培养于含100mL/L小牛血清的Rpmi1640培养液中，放置于37℃、50mL/LCo2、饱和湿度的培养箱中，用2.5g/L的胰蛋白酶常规传代培养。实验时用处于对数生长期的细胞。
1.3照射方式及实验分组光动力激光治疗仪的红光(波长630nm，功率300mw)经光导纤维引出后，垂直照射细胞。实验分为空白对照组、单纯顺铂治疗组(DDp)、单纯光动力治疗(pDt)组、顺铂和光动力联合治疗组，其中后者又分为先顺铂后光动力治疗组(DDppDt)和先光动力后顺铂治疗组(pDtDDp)。
1.4mtt法筛选aLa浓度和激光能量的最佳组合参数取处于对数生长期的Hela和Siha细胞，以5×104个/孔的密度接种于96孔培养板中，培养24h后加入用不含血清的Rpmi1640培养液稀释的aLa，使其终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2、4mmol/L。均设有单独培养液的空白对照组、单纯给药组和单纯照射组。每组3个复孔。加入aLa后在孵箱内避光培养6h，将含药液弃去，进行激光照射，激光波长630nm，由上而下垂直照射在单层细胞上，激光能量分别为1、5、10、20J/cm24种照射剂量。照射完毕后，给细胞更换含有血清的Rpmi1640培养液，避光培养24h。然后弃去培养液，每孔加入180μL新鲜无血清Rpmi1640培养液和20μL浓度为5mg/mL的mtt溶液，37℃避光孵育4h。小心吸弃孔内培养液上清，每孔加入150μLDmSo，避光振荡10min后，以490nm为测量波长，620nm为参考波长，在全自动酶标仪上测定各孔的吸光度值(a)，各平行孔的a值取平均数。计算细胞增殖抑制率，公式：细胞增殖抑制率=[(对照组a值-空白组a值)-(实验组a值-空白组a值)]/(对照组a值-空白组a值)×100%。采用改进寇氏法[2]计算半数抑制量(iC50)。重复3次以上，计算均值。
1.5mtt法检测人宫颈癌Hela和Siha细胞对顺铂的敏感性Hela和Siha细胞培养24h后加入用不含血清的Rpmi1640培养液稀释的顺铂，使其终浓度分别为0.1、1、2.5、5、10、20mg/L。均设有单独培养液的空白对照组，每组3个复孔。在孵箱内避光培养24h，在酶标仪上测定各孔的a值，计算细胞增殖抑制率和iC50。
1.6mtt法检测各组Hela和Siha细胞的增殖情况
DDppDt组的Hela和Siha细胞培养24h后加入终浓度为0.1、1、2.5、5、10、20mmol/L的顺铂，孵箱内避光培养24h。去掉培养基，pBS清洗，加入1mmol/L的aLa在孵箱内避光培养6h，将含药液弃去，进行激光照射，激光波长630nm，由上而下垂直照射在单层细胞上，激光能量为5J/cm2。照射后更换为无药培养基，避光孵育24h，在全自动酶标仪上测定各孔的a值，计算细胞增殖抑制率。pDtDDp组先光动力治疗后顺铂，其余检测步骤相同。
1.7免疫细胞化学法检测各组宫颈癌细胞p185cerbB2的表达Hela、Siha细胞Rpmi1640培养液常规培养，取对数生长期细胞调整浓度至5×105个/孔，接种于放有消毒盖玻片的6孔板，37℃、50mL/LCo2孵
育48h。pDt组用1mmol/LaLa和5J/cm2激光处理后孵育24h;DDp组用10mg/L顺铂处理24h;DDppDt组先用10mg/L顺铂处理24h，再用1mmol/LaLa和5J/cm2激光处理后孵育24h;pDtDDp先用1mmol/LaLa和5J/cm2激光处理后孵育24h，再用10mg/L顺铂处理24h。处理完毕后，用丙酮溶液固定，室温干燥;用30mL/LH2o2甲醇溶液去除细胞内源性过氧化物酶活性;滴加正常羊血清封闭液室温封闭40min;弃去封闭液，用以1∶200比例稀释的一抗在湿盒内4℃过夜;滴加稀释好的生物素标记山羊抗兔igG(二抗)37℃于湿盒内孵育30min;滴加DaB显色液，苏木素染色，用中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。实验重复3次。光学显微镜200倍放大下任选10个视野，未见阳性细胞为(-)，阳性细胞数/100个细胞50%为()。
1.8数据资料的分析数据在excel和SpSS17.0中进行计算和统计。所有数据用均数±标准差表示，经正态分布和方差齐性检验后，进行单因素方差分析，方差齐的用SnK两两比较，方差不齐的采用tamhane两两比较，α=0.05。
2结果
2.1不同aLa浓度和激光能量照射对宫颈癌细胞Hela和Siha增殖的影响mtt实验结果表明，单纯激光组对两种细胞增殖均无影响(p>0.05)。在单纯光敏剂组中，当aLa0.05)，当aLa≥2mmol/L时抑制率随药物浓度增加而明显升高(2mmol/L：Hela6.91%，Siha4.412%;4mmol/L：Hela8.412%，Siha5.154%)，与正常对照组相比差异有统计学意义(p
(p0.05，表1、表2)。表1mtt法测定不同aLa浓度及不同光照剂量对Hela细胞增殖抑制率的影响与对照组(aLa浓度和光照剂量均为0)相比较，*p
2.2人宫颈癌Hela和Siha细胞对顺铂敏感性的影响mtt结果显示，Hela和Siha细胞的不同浓度顺铂组与各自的对照组相比抑制率均有统计学差异(p
2.3比较各组Hela和Siha细胞的增殖抑制顺铂浓度相同时，单纯顺铂组与DDppDt组和pDtDDp组比较，差异均有统计学意义(p0.05)。DDppDt组和pDtDDp组与单纯光动力组(1mmol/LaLa和5J/cm2)比较，差异有统计学意义(p
2.4免疫细胞化学法检测DDp组、pDt组、DDppDt组和pDtDDp组细胞p185cerbB2的表达阴性组是在实验过程中用pBS替换一抗过夜，其他步骤相同;对照组是未做任何处理的宫颈癌细胞，pDt组是用1mmol/LaLa和5J/cm2处理24h的宫颈癌细胞，其他条件相同。结果显示，DDp、aLapDt和DDp与aLaDDp联合均可显著抑制细胞中p185cerbB2蛋白表达，与对照组之间差异有统计学意义(p
3讨论
宫颈癌细胞对化疗药物耐药是抑制癌细胞凋亡、化疗失败的主要原因，克服耐药将成为提高进展型宫颈癌5年生存率的关键。光动力治疗突出的优点在于杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞影响较小，毒副作用轻[67]。aLa本身不具有光敏性，在一系列酶的作用下能生成具有强光敏作用的ppⅨ，不同细胞对aLapDt的敏感性不同[89]。
本研究结果显示，顺铂和光动力治疗联合应用，导致细胞凋亡的程度均明显强于单一顺铂作用或光动力作用，细胞中p185cerbB2蛋白的表达下降程度也与之一致，细胞凋亡可能与p185cerbB2蛋白相关。
但是先顺铂后光动力治疗和先光动力后顺铂治疗相比，作用效果差异不明显。提示临床用药时，可以对耐受顺铂患者或治疗效果不明显的患者，适当搭配以光动力治疗。可以探索化疗药物与光敏剂、光照剂量之间的最佳组合参数，以获得更好的治疗效果。
a：阴性组;B：对照组;C：aLapDt组;D：DDp组;e：先aLapDt后DDp组;F：先DDp后aLapDt组。
此外，还可以研究通过某种偶联物将顺铂和光敏剂特异性结合，降低毒性和副作用，提高对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。
总之，本实验为临床宫颈癌施行光动力治疗时，用小剂量顺铂增敏，以减少光敏剂和化疗药用量，更重要的是为未来提高光动力治疗敏感性的基因治疗提供了理论依据。
参考文献
[1]王玉萍，邵斌，曹静，等.顺铂诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其对细胞周期影响的研究[J].中国妇幼保健，2006，21(21):29852986.
[2]凌斌，祝怀萍，江森，等.热疗增强顺铂对子宫颈癌细胞化疗作用的体外实验研究[J].安徽医科大学学报，1999，34(1):3335.
[3]贺桂芳，卞美璐，赵亚薇，等.5氨基酮戊酸光动力疗法对宫颈癌细胞株凋亡的诱导作用[J].癌症，2008，27(9):897904.
[4]FUJiwaKiR，taKaHaSHiK，Kitaom，etal.Decreaseintumorvolumeandhistologicresponsetointraorterialneoadjuvantchemotherapyinpatientswithcervicalandendometrialadenocarcinoma[J].Gynecoloncol，1997，65(2):258264.
[5]姜玉华，程玉峰，刘慧忠，等.小剂量顺铂对放射治疗hela细胞肿瘤增敏作用的实验研究[J].山东医科大学学报，2001，39(5):406407.
[6]VRoUenRaetSmB，ViSSeRGw，SnowGB，etal.Basicprinciples，applicationsinoncologyandimprovedselectivityofphotodynamictherapy[J].anticancerRes，2003，23(1B):505522.
[7]oCHSneRm.photophysicalandphotobiologicalprocessesinthephotodynamnictherapyoftumors[J].JphotochemphotobiolB，1997，39(1):118.
细胞生物治疗法篇10
让癌症治疗不再简单粗暴
4000年以来，我们对癌症的恐惧从来不曾消失，因为它意味着生命的尽头和痛苦的治疗。
癌症已经成为人类健康的头号杀手。目前，我国每年有超过150万人死于癌症，每5位死者中，便有1人死于癌症。大约在公元前2500年，人类第一次有了关于癌症的记录。4000年以来，我们对癌症的恐惧从来不曾消失，因为它意味着生命的尽头和痛苦的治疗。
标准的癌症治疗手段过于简单粗暴
虽然，良好的生活习惯能够预防与慢性感染和烟草相关的癌症，但是衰老与衰老所累积的基因突变等致癌因素却不可避免。积极的预防并不能够解决所有问题，总有一些人会不幸患癌。更糟糕的是，患者和他们的家属不仅要忍受疾病的痛苦，还需要忍受治疗之苦。
现今，手术、化疗、放疗是癌症治疗的三驾马车，它们有效，但是过于简单粗暴。不论是用刀切、用放射线烧，还是用药物毒死癌细胞，我们的健康细胞都会跟着遭殃，或者有癌细胞成为漏网之鱼。这些疗法就像是一个盲人拿着机关枪乱扫一通，不分敌我。到了癌症晚期，即使患者忍受了这些痛苦的治疗，也收效甚微。
智慧型的癌症疗法将成为疾病的终结者
难道就没有更智慧的癌症治疗方法吗？随着科技的进步，和医学工作者持之以恒的努力，Rna干扰技术、纳米技术、微生物技术、免疫疗法等新方法将更加精确、高效、持久地抗击癌症。Rna干扰技术能够让利于癌症生长的基因失去作用，纳米技术可以减少药物的毒副作用和增强药效，微生物技术可以让病毒和细菌成为我们的抗癌雇佣兵，而免疫疗法则使我们的免疫系统全面清除癌细胞。
利用这些新技术开发的药物有的已经用于临床，例如，用免疫细胞制作的癌症治疗疫苗provenge已经上市，用于治疗晚期前列腺癌，能够延长患者的生命。还有更多的新式抗癌药物正在临床试验阶段，例如治疗肝癌的Rna干扰药物和治疗多种实体肿瘤的靶向性纳米药物。
当然，有时候可能结果并不符合研究者们的设想，但是，他们坚信，这些智慧型药物才是癌症的终结者。随着微生物、纳米和遗传工程学技术的进步，以及我们对于不同种类癌症和自身免疫系统了解的增多，难关将被一一攻克，癌症也将变得不再可怕。
未来战士1
纳米技术——让药物瞄准癌细胞
如果说，化疗药物可能因为各种原因让健康细胞“躺着也中枪”，那么纳米技术就是来帮助它们更精准地“杀敌”。
纳米技术，让“毒药”起死回生
纳米是计量长度的单位，所以它本身并不能够治疗癌症，但是纳米级的分子却能够解决许多抗癌药物的问题。药物可能伤害健康细胞，也可能在到达目标细胞之前便被吸收，而纳米材料却可以解决这些问题。纳米技术可以让Rna干扰等新抗癌技术真正运用到临床中去，也可以让许多早已因为毒副作用被打入冷宫的抗癌药物“起死回生”。
让药物能更好地渗入肿瘤血管
大多数的化疗药物都是通过杀死快速增殖的细胞来抑制癌症，可是除了癌细胞以外，我们的皮肤、肠道和免疫系统中还存在许多快速增殖的健康细胞。在化疗过程中，这些健康细胞经常“躺着也中枪”。有时为了保护快速增殖的健康细胞，只能降低化疗剂量，但这样一来，癌细胞又得到了喘息的机会。相比普通血管，纳米级的药物更容易渗入肿瘤血管，因此，药物将在肿瘤处聚集，放过其他血管。把化疗药物跟纳米技术相结合，就是为了集中火力，把所有子弹送进敌人的胸膛，避免自己人受伤。
给纳米药物加上更精确的导航系统
纳米级的药物“路过”肿瘤血管时，会渗入其中，但是并不会主动寻找肿瘤。于是，只是制作纳米级的药物并不能够满足药物研发者们对抗癌药物的要求，他们还希望给这些药物加上一个导航系统。把能够“找到”癌症蛋白质的抗体附着到纳米级的药物上，药物就会直接找到癌症，这种药物被称作靶向性纳米药物。由于几乎所有的靶向性纳米药物都能够不被浪费地到达肿瘤处，因此，即使是很低的剂量，也可以发挥很好的作用。
旧药装上新补丁：用量更少，效果更好
第一类能够达到临床评估的靶向性纳米药物是BinD公司的新药DtXL-tnp。其中的DtXL为FDa（美国食品与药物管理局）早已批准的传统化疗药物多紫杉醇，而tnp就如同它的补丁，让它效果更好，用量更少。
第一步：制作补丁根据大小、载药量、释药特性等的不同，研究者从100多种纳米微粒中选出了最佳的一种，然后再将前列腺癌特异膜抗原的抗体附着于上。因为这些抗原存在于前列腺癌细胞和大多数非前列腺实体肿瘤的新生血管上，所以带有其抗体的纳米微粒能够迅速找到肿瘤。这种名为靶向性聚合纳米微粒（tnp）的细微分子将填补传统化疗药物不分敌我的漏洞。
第二步：安装补丁接着，研发者把传统的化疗药物注入到靶向性聚合纳米微粒中，药物便会被微粒精确地带到肿瘤处。微粒的释药特性能够让血液中的药物浓度长久保持较高水平，延长药效。在小鼠试验中，这种新药的血液循环半衰期可达到约20个小时之久。药物不仅能更长时间地发挥作用，在肝脏的聚集量也大幅度降低，变得更加安全。
第三步：成果测试与传统化疗药物相比，给药后12个小时中，纳米药物在小鼠肿瘤处的聚集明显增多。给药24小时后，纳米药物在小鼠血液中的浓度一直维持在传统化疗药物的100倍，药物的生物学效应得到明显改善。而最初的临床试验也表明，相比使用常规剂量的传统化疗药物，晚期实体肿瘤患者在使用了更低剂量的纳米药物后，肿瘤有了更明显的萎缩。简单地说，纳米微粒的运输，让药物使用达到了剂量更少，效果更好的目的。
未来战士2
Rna干扰技术——关掉癌症基因
只是杀死癌细胞，它们还会长出来，可是如果关掉了癌症基因，那么便一劳永逸了。就好像厕所漏水了，你不能只舀水，必须得关掉水龙头，不然，水永远都舀不干。Rna干扰技术就是关掉癌症基因的希望所在。
Rna干扰=让癌症基因不致病
给矮牵牛花注入了催生红色素的基因后，花朵理应变得更鲜红，结果却是，花瓣褪成了白色。后来科学家们发现，这种奇怪的现象是因为矮牵牛花自身的Rna干扰现象让催生红色素的基因沉默了。这是因为，Dna是携带着蛋白质编码的基因，而mRna是Dna和蛋白质之间传递编码信息的“中间人”，如果mRna扰了，那对应的基因就失去了作用。如果我们能够让癌症的基因沉默，那么即使你拥有癌症基因，也不会患癌症。
怎样利用Rna干扰治病
许多生物，尤其是低等生物，都是依靠Rna干扰来抵抗病毒的入侵，例如，植物、蠕虫和果蝇体内都存在这种原始的Rna级别抗病毒机制。但是，包括人类在内的脊椎动物体内却没有这种抗病毒机制。现在，在人类身上，研究者们希望运用Rna干扰技术使特定的基因沉默，例如让可导致胆固醇升高、病毒感染、内分泌紊乱的基因沉默，从而达到治疗疾病的目的。
让基因沉默的具体工作是由小干扰片段完成的，它们会截杀传递基因信号的mRna，让相应的蛋白质无法合成。小干扰片段只截杀与其碱基配对的mRna，所以具有特异性，这是抗癌药物梦寐以求的。把针对癌症基因的小干扰片段注入癌症患者体内，他们的癌症基因就会保持沉默，癌症也就会停止生长。健康mRna的碱基与这些小干扰片段并不符，因此不会受到影响。但是，想要让小干扰片段截杀正确的mRna，就必须先知道这个mRna参与合成哪一种蛋白质。
资料库：小干扰片段是什么
小干扰片段是Rna干扰的一个中间产物。1998年美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛发现，Rna的编码链被称作“正义”链，与之互补的Rna链被称作“反义”链。一正一反两条Rna链集合在一起形成了双链Rna。蛋白质复合体Dicer附着其上后，会将其切割成许多小干扰片段，即siRna。然后，蛋白质复合体RiSC会再与这些片段结合，清除其中一条Rna链，剩余的一条成为探测mRna（信使Rna）分子的探针。当一条mRna分子与RiSC复合体上的Rn段通过碱基配对的形式结合时，该mRna分子便会被剪切并降解，其对应的基因也就沉默了。这一现象被称为Rna干扰。
以致病蛋白质为线索制药
以生物技术公司alnylam治疗感染肝癌的Rna干扰药物aLn-VSp为例，药物研发者把癌细胞大量制造的两种蛋白质作为线索。第一种蛋白质能帮助肿瘤血管的新生，用于向癌细胞运输血液，第二种蛋白质则能够让癌细胞加速生长。于是，针对这两种蛋白质，研发者设计出了截杀其mRna的小干扰片段，然后将这些小干扰片段注入患者体内。这些小干扰片段与负责生产两种致病蛋白质的mRna配对，然后将它们分解掉，这样就切断了致病蛋白质的生产链，从而抑制了癌症的生长。
纳米材料让药物安全到达敌营
但小干扰片段也有缺点，在自然的Rna干扰过程中，它们很快就会降解，于是在治疗癌症时，如何才能保证它们“安全”到达肿瘤处是一个问题。制造出特定的小干扰片段后，还必须有能够保护它们的“运输工具”，以免它们“出师未捷身先死”。因此，药物研发者又设计了一种脂质的纳米材料，它只能够被肝脏吸收。把小干扰片段藏到这种脂质纳米微粒中，它们在到达肝脏以前都能够保持完整，而到达肝脏后，纳米材料被吸收，小干扰片段便会出来阻断癌症基因发出的信号。小干扰片段如果是士兵，那么纳米材料就是把士兵安全运输到敌营的坦克。
断掉肿瘤生长的后路
在首次临床试验中，化疗失败的19名肝癌患者服用了aLn-VSp数周内，药物便开始阻止致病蛋白质的生成，使病情有了明显好转。核磁共振成像显示，患者体内肿瘤62%的血流被切断了。肿瘤无法获得养分，只能停止生长。今年alnylam公司与中美合资的世方药业有限公司结成合作伙伴，将在中国共同开发这种纳米药物，用于治疗包括原发性肝癌的各类肝癌。
BruceSullenger是美国杜克大学一位研究Rna干扰的分子生物学家，他说：“我们现在已经可以利用Rna干扰使2万个基因沉默，剩下的工作就是如何制造出载体让Rna干扰能够准确地到达目标细胞。”除了aLn-VSp以外，还有很多其他Rna干扰药物已经进入临床试验阶段，希望在不久的将来，Rna干扰药物能够成为“包治百病”的灵丹妙药。
现在处于临床试验阶段的Rna干扰药物
未来战士3
微生物改造——化敌为友，共同抗癌
敌人的敌人便是朋友，这个原则也同样适用于癌症治疗。病毒和细菌原本是我们的敌人，可是，如果让它们感染和杀死癌症细胞，那么它们便成为我们抗癌的雇佣兵。
让病毒成为我们的抗癌雇佣兵
病毒的天性是侵占我们的细胞，然后在其中繁殖，直到细胞死亡，再去侵占更多的细胞。如果我们能够操作病毒，使其只攻击癌细胞，那么病毒便不再可怕，它们将成为我们对付癌症的重要战略伙伴。这个想法并不新鲜，早在20世纪50年代便有人希望利用病毒的破坏力来对付癌症。各式各样的病毒被注入患者的肿瘤中，但有时候病毒感染会迅速蔓延开，并且导致致命的后果。以毒攻毒有可能变成玩火自焚。
而如今，利用基因技术改造病毒，可以让它们只感染肿瘤细胞，还能让它们在肿瘤细胞中的繁殖更加疯狂，最终能够把肿瘤“吞噬”干净。现在，至少有10个种类的病毒在接受基因改造后被用于癌症治疗的研究，而BioVex公司的oncoVeXGm-CSF可能是目前为止效果最好的这类药物。Gm-CSF是英文“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”的首字母缩写，这是一种强劲的免疫化学物质，能够刺激免疫系统辨别和攻击癌细胞。基因被改造后的疱疹病毒再“带上”这种免疫化学物质，就变成了能够治疗癌症的病毒。这种治疗性病毒通过两种方式起作用：第一，直接入侵癌细胞，并在其中繁殖和杀死宿主癌细胞；第二，告诉身体制造更多能刺激免疫系统抗癌的化学物质。这种双管齐下的治疗性病毒，可用于治疗黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症。
在临床试验中，已发生转移的50位黑色素瘤患者中，有8位患者的肿瘤完全消失了，而且疗效持续时间长。对于存活率极低的晚期黑色素瘤患者来说，这是一个天大的好消息。另外，据参与试验的患者反映，这种以病毒为载体的药物所带来的副作用和不适感要远远小于干扰素（干扰素常用于癌症治疗中，毒副反应较为明显）。现在，这种治疗性病毒已经进入了临床试验的第3阶段，也许在不久的将来便能够造福更多的患者。
拔掉艾滋病病毒的毒牙
全球的免疫学家都在积极寻找更多适合抗癌的病毒，美国宾夕法尼亚大学的研究者便看中了艾滋病病毒强大的感染能力。首先，他们通过基因改造去掉了艾滋病病毒的致病能力，使其成为缺陷型病毒。然后，他们把缺陷型病毒的基因插入人体免疫系统的t细胞中，这样t细胞便会如同艾滋病病毒一样疯狂地攻击癌细胞和大量繁殖。3位接受这种实验性的病毒疗法的血癌患者中，有2位患者痊愈，1位患者病情得到控制。而在此前，化疗已经对这3位患者不再产生作用，而且他们也没有接受骨髓移植的机会。可以说是艾滋病病毒救了这些血癌患者一命。
寻找天生的癌症捕杀者
除了利用基因改造后的病毒去杀死癌细胞，研究者们还在寻找天生就只杀死癌细胞的病毒。neotropix公司的抗癌药物ntX-010所选用的病毒，天然就只感染和杀死癌细胞，不需要基因改造。药物注射入患者体内后，病毒会有选择性地感染和杀死神经内分泌癌细胞。在临床试验中，一些走投无路的小细胞肺癌（神经内分泌癌的一种，恶性程度较高）患者的病情得到了不错的控制。不过，这种治疗性病毒并不能歼灭所有的癌细胞，它们杀死癌细胞的速度与癌细胞生长的速度达成了一个平衡。肿瘤虽然不会缩小，可会停止长大，患者的生命也将得到延长。以病毒为载体的抗癌药物研究还只是一个开始，还有很多以病毒为载体的药物正在动物试验阶段。
细菌打起癌症包围战
说起病毒便不能忘记另外一种寄生在我们体内的微生物——细菌。许多菌株，包括沙门氏菌和大肠杆菌，都倾向于寄宿在肿瘤中，因为在氧气稀少的肿瘤中心，这些细菌能够躲过人体免疫系统对它们的追捕，还能够以癌细胞的代谢产物为食。接受过基因改造的细菌能够按照我们的要求释放毒素或者在指定的地点完成其他任务。
这与病毒疗法十分相似。不过，相比改造病毒，细菌更容易大量培养，而且在基因改造的过程中也更容易控制。更好的是，细菌还会作用于被病毒忽略掉的肿瘤基质细胞，它们本身不是癌细胞，但是却会支持癌细胞的生长。肿瘤的80%都是由这些基质细胞构成的。所以，细菌疗法不仅能够直指敌人的大本营，还能包围敌人。
给益生菌装上抗癌武器
2010年，爱尔兰库克癌症研究中心的主要研究人员tangney改造了一种无害的肠道细菌，短双歧杆菌的基因用于追踪小鼠的皮下肿瘤。结果显示，即使是口服，这种抗癌细菌也可以通过胃肠道，最终到达肿瘤处，并在其中繁殖，其效果与静脉注射的给药方式几乎相同。在给药2周后，细菌仍然在小鼠的肿瘤处工作，而且小鼠在整个实验中都没有因为细菌感染而患病。
以无害的益生菌作为载体，插入“报道基因”，医生便能通过这些细菌找到患者体内容易被忽略的癌细胞；插入“治疗基因”，则可以用这些细菌来杀死癌细胞。不过，由于细菌疗法是比病毒疗法更新的技术，还处在实验室研究阶段，所以没有相关的临床试验案例。
未来战士4
免疫疗法——启动我们天生的抗癌引擎
我们的免疫系统在面对癌症的时候并不是束手就擒的，它们也会反抗，只不过大多数时候都失败了。有一些幸运的患者发现，自己的肿瘤自然消失了，这其实是自身免疫系统在对抗癌症的战役中迎来了迟到的爆发。癌症的免疫疗法就是要让我们的免疫系统重新加入战争，并最终赢得胜利。
免疫系统让肿瘤不治而愈
免疫疗法的概念诞生于19世纪80年代，这都得益于美国纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心的一位外科医生——Coley。他发现在抗生素发明以前，癌症患者在切除肿瘤后并不容易复发，而在抗生素发明以后，切除肿瘤后，患者的癌症反而变得容易复发了。另外，一些肿瘤自然消失的患者，都几乎有过急性感染的经历，有的人患过麻疹，有的人患过流感，还有的人患过疟疾。把这些综合起来思考，Coley怀疑，是感染让患者的免疫系统在对付病毒或者细菌的时候也顺便清除掉了癌细胞。因此抗生素虽然让癌症患者避免了手术后受到感染，但是也让其失去了清理癌细胞的机会。
在18世纪，一些外科手术医生也注意到了感染就像是某种原始的“免疫疗法”，可以清除手术所遗漏的癌细胞。因此，他们会故意不做好消毒工作，有的甚至会大胆地将疟疾或者梅毒病毒注入癌症患者体内。有时候，这种原始的“免疫疗法”真的能够成功。不过医疗发展到Coley的时代，故意感染患者显然是不可行的，但仍然有一些意外受到感染的患者，他们的肿瘤会自行消失。Coley告诉纽约医学院，如果感染能够清除肿瘤，那么类似的人为操作应该也能够达到相同的目的。
链球菌刺激免疫系统抗癌
链球菌是一种能够引起扁桃体炎等感染性疾病的细菌，但是又不如梅毒或者结核杆菌那样致命。在1981年5月，Coley给一位自愿的肿瘤患者在肿瘤处直接注射了链球菌。这位患者的颈部和扁桃体都长有肿瘤，之前的手术后，肿瘤复发并且生长迅速。Coley为他治疗的前两个月，他几乎每天都注射链球菌，而肿瘤真的萎缩了。到了8月，Coley停止了注射，肿瘤再次开始生长。于是，Coley又给患者注射了一种更为强劲的链球菌，这次患者开始高烧，但两周后，其颈部的肿瘤完全消失了。两年后，这位患者颈部的肿瘤仍然没有复发，扁桃体的肿瘤虽然没有消失，但也没有继续长大。
之后，Coley开始用这个方法治疗其他患者。其中一位患者的肿瘤迟迟无法消失，直到Coley给他注射了另外一种能引起他发烧的链球菌。接着的24小时中，Coley眼睁睁地看着肿瘤一点点地消失了。似乎发烧是让这个疗法发挥作用的核心所在。但有的时候，即使天天注射也无法让患者发烧，可还有时候，一次注射便让患者的感染情况一发不可收拾。因此，他制造了一种混合死链球菌和黏质沙雷氏菌的注射液，并称其为Coley毒素。这种药物会造成患者高烧，但是却不会引起真正的感染。Coley强调，重要的并不是细菌的种类，而是要保证注射液能够注射到肿瘤的深处，而且必须引起患者发烧，这样持续几周甚至几个月，肿瘤便能够萎缩甚至消失。
免疫疗法研究仍在继续
我们在“发烧”的时候，免疫系统的工作效率最高，这个时候身体会制造更多的免疫细胞，而且这些免疫细胞的活动范围广、攻击能力强。越来越多的研究显示，一个人受到感染并且发烧的次数越多，他患某些种类癌症的几率便越小。可以说，发烧是我们天生抵御疾病的引擎。Coley就是靠着刺激身体发烧成功治愈了许多患者，甚至是一些肿瘤已经发生转移的患者。
但是，Coley也遇到了很多困难，例如，如何才能够调配出适合每一位患者的细菌注射液，还有如何让免疫系统保持“亢奋”。1936年，Coley去世后，他的Coley毒素也逐渐被更容易预测效果的放疗和化疗取代。但是，对于免疫疗法的研究并没有因此而停止。
在免疫疗法沉寂了一段时间后，研究者们又开始重新研究如何利用我们天生的防御机制来对抗癌症。不同于Coley的是，现在随着对免疫系统的了解的加深，科学家们更清楚地了解到抗原、抗体、免疫细胞在我们身体防御机制中所扮演的角色，因此能够更加精确地去操控免疫细胞。再结合最先进的生物技术，他们可以通过各种方法让免疫细胞去攻击癌细胞，包括给患者注射癌症抗原、培育更多免疫细胞、改造免疫细胞的基因等等。
“疫苗”是免疫系统的抗癌启动按钮
把病毒抗原或者灭活的病毒注入患者体内，患者便会产生抗体，其免疫系统就能够识别和清除病毒，这就是疫苗的作用。现在，科学家们希望像对付细菌和病毒一样来对付癌细胞。最简单的方法是使用抗原疫苗：给患者注入癌细胞特有的蛋白质（即抗原），或者带有抗原的已死癌细胞，刺激患者的免疫系统自动识别和杀死癌细胞。如果说，免疫系统清除掉身体内的癌细胞是一项复杂的工作，那么疫苗就是启动按钮，一旦触动，免疫细胞便开始奋力杀敌。
让免疫系统不停工作——Dna疫苗
设想是美好的，但现实是残酷的。在过去的几十年里，数百名患者于临床试验中接种了治疗癌症的抗原疫苗，动物实验更是不计其数，但都以失败告终。总结一下原因，如下：第一，肿瘤会对免疫系统发出一种撤退的信号；第二，大多数患者的免疫系统因为放疗已经脆弱不堪；第三，免疫系统要杀死癌细胞必须同时依靠免疫细胞和抗体，但抗原疫苗虽然善于诱导免疫系统产生抗体，可却不善于刺激免疫系统产生免疫细胞，然而，最终要真正杀死癌细胞却得靠免疫细胞。在困难重重的环境中，抗原疫苗刚开始还能起到一些作用，但等免疫系统适应了之后，就会停止工作。
现在，英国南开普敦大学的研究者改变了思路，寻找其他办法来激活免疫系统。他们不再给患者直接注射抗原，而是把负责制造抗原的Dna放入一种载体中，制成Dna疫苗。一旦这种Dna疫苗注射入患者的手臂肌肉中，那里的肌肉细胞便会遵循新的基因指示，开始源源不断地产生抗原，直到它到达细胞的表面。
以往，直接注射抗原后，抗原会在血管中随波逐流，或者只是依附于已死的癌细胞上，很难真正刺激免疫系统产生免疫细胞。而现在注射了Dna疫苗，细胞产生的抗原依附于细胞的表面，只有这样的抗原才能达到刺激免疫系统产生免疫细胞的目的。Dna疫苗的另外一个好处是，由于细胞会持续不断地产生抗原，所以免疫系统会一直得到刺激，对癌症的追击便不会停止。目前，已有几种Dna疫苗在进行小规模的临床试验。
给t细胞找个帮手——树突状细胞疫苗
树突状细胞是一种特殊的免疫细胞，它能帮助免疫系统辨别癌细胞，还能将癌细胞分解为带有抗原的小碎片，让免疫系统中的t细胞更容易找到并且清除这些癌细胞片段。总的来说，树突状细胞的工作就是为了方便免疫系统识别和杀死癌细胞，但其数量非常稀少。
研究者先从患者的血液中获取免疫细胞，然后在实验室中让这些免疫细胞暴露于癌细胞或者癌症抗原中，接着再用一些化学物质让免疫细胞转变成树突状细胞，并让树突状细胞大量增殖。最后，树突状细胞被注射回患者体内，并刺激免疫系统对身体内的癌细胞做出反应，诱导t细胞将癌细胞杀死。这种把免疫细胞植回患者体内的做法叫过继性免疫疗法。
因为树突状细胞疫苗是一种自体同源的疫苗（即利用患者自身的免疫细胞制作疫苗），所以每一个患者的疫苗都是“私人定制”，无法批量生产，是疫苗中的奢侈品。美国Dendreon公司研发的provenge疫苗便属于治疗晚期前列腺癌的树突状细胞疫苗，也是FDa首个批准用于治疗肿瘤的疫苗。这种疫苗治疗一个病人的开支高达9.3万美元，疗法为一个月内注射三次，平均能够为患者延长4个月的寿命。
训练癌症杀手——t细胞疫苗
树突状细胞毕竟不能直接杀死癌细胞，因此有研发者直接培育能杀死癌细胞的t细胞。研究者从患者切除下来的肿瘤中获取t细胞，培育后再注射回患者体内，也属于“私人定制”类的疫苗。如果再结合放疗与去除免疫抑制细胞，t细胞疫苗甚至能治愈晚期黑色素瘤，而在此之前，医生们面对这种癌症几乎都无力回天。美国国家癌症研究所（nCi）的StevenRosenberg医生，在美国国立卫生研究院（niH）附属临床研究中心进行了t细胞疫苗的临床试验。结果显示，在接受治疗的93位晚期黑色素瘤患者中，有20人的肿瘤完全消失，而且其中19人在5年后都没有复发。总共52位患者的肿瘤有了明显萎缩。
但科学家们并不满足于现在的结果，他们已经开始着手给患者的t细胞做基因改造，将能够识别癌症的基因插入t细胞中，使t细胞更有效地攻击癌细胞。随着技术的进步，我们将可能通过基因改造，制造出各种全新的细胞类型，而将免疫疗法与遗传工程相结合是现今最前沿的研究。少数与大学挂钩的医疗中心已对一些绝症患者进行了相关的临床试验，而部分患者的情况显示，这可能成为癌症的真正终结者。
盘点2012癌症研究十大突破
1杀死癌症干细胞的药物
据《细胞》杂志报道，一个癌症干细胞研究团队的领导者mickBhatia博士发现，甲硫哒嗪（一种抗癌药物）可以在不损伤正常干细胞的前提下，杀死诱发白血病的癌症干细胞。这是一项重大的发现，因为癌症干细胞可以持续分化，进而发展为癌症，并且它也是导致癌症复发的一个常见原因。
2破解致死乳腺癌的基因
三阴性乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌，死亡率高，患者的雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体均成阴性，并且尚无针对性的标准治疗方案。但Vanderbilt-ingram癌症中心的研究人员破解了关于三阴性乳腺癌的基因，发现其患者的许多基因都发生了变化，例如mYC、mCL1和JaK2发生了基因扩增，而pi3K基因却发生了突变。了解有关于三阴性乳腺癌的基因异常，有利于疾病的诊断，以及研发出更有针对性和个性化的疗法。
3提高罕见胰腺癌患者存活率
胰腺癌的死亡率极高，但加拿大国家癌症研究所一个临床研究小组发现，一种较为罕见的胰腺癌——壶腹周围癌，如果治疗得当，患者的寿命将会延长。壶腹周围癌患者在接受了手术切除肿瘤后，继续进行氟尿嘧啶或者吉西他滨的化疗，那么存活率将会明显提高。
4维生素D或可抑制癌症生长
加拿大安大略癌症研究所的Johnwhite博士及其研究小组，对一种名叫cmYC（寡核苷酸）的蛋白质进行了研究，至少50%的癌症患者体内这种蛋白质的含量会升高。研究发现，维生素D可以阻断cmYC的生成。该项发现对未来研究和了解维生素D在阻断癌症生长过程中的作用有重大意义。
5儿童恶性脑癌新疗法
随母细胞瘤是一种儿童后颅恶性胶质瘤。在此之前，我们认为所有的随母细胞瘤都一样，采用的也是同一种标准治疗方法，但许多患儿因此接受了过度治疗。加拿大多伦多病童医院的taylor医生带领一个国际研究小组发现，随母细胞瘤有四个分型，情况也有轻有重。如果能够在治疗患儿以前先确认到底是哪一种分型，那么治疗将更有针对性，也避免了对于病情较轻的患儿过度使用放疗。放疗可能带来长期的副作用，包括损害患儿的大脑结构。
6天然海绵可以预防癌症导致的肌肉萎缩
肌肉萎缩，也叫作恶病质，是由癌症引起肌肉或体重减少的一种疾病。癌症死亡者中，大约30%是死于肌肉萎缩。加拿大麦吉尔大学的研究团队在蒙特利尔发现，在小鼠实验中，一种源自于海绵的天然产品可以有效预防肌肉萎缩。该研究首次为肌肉萎缩患者提供了一个潜在的治疗方法。
7甲氟奎抗癌大有前景
急性骨髓性白血病是一种血液和骨髓癌症，如果治疗不及时，可能会引发更为严重的后果。加拿大麦吉尔大学的aaronSchimmer博士以及他的同事对多种药物进行了检测，希望确定其中是否有药物可以攻击急性骨髓性白血病细胞。最终研究发现，甲氟奎，一种常用于治疗疟疾的药物，可以导致急性骨髓性白血病细胞破裂。
8只化疗对霍奇金淋巴瘤更好
加拿大国家癌症研究所的另一个临床试验小组发现，局限期的霍奇金淋巴瘤患者如果只接受化疗，比接受化疗并接受放疗的患者活的时间更长。化疗联合放疗一直都是对付癌症的有利武器，此前，90%的霍奇金淋巴瘤患者都同时接受达卡巴嗪化疗和次全淋巴结照射放疗，但实际上，这种双管齐下的疗法可能让患者更快走向死亡。
9罕见癌症的智能疗法
加拿大英属哥伦比亚大学的torstennielsen博士及其团队，日前揭示了基因突变与蛋白质相互作用引发癌症的过程。这种基因变体可以引起一种罕见但是致命的癌症（滑膜肉瘤）的增生。研究人员发现，通过药物或者基因抑制剂能够阻止这些致病蛋白质的生成，从而杀死肿瘤细胞。